Ανάλυση PCR - τι είναι; Πρόκειται για μια αποτελεσματική μέθοδο μοριακής βιολογίας, η οποία χρησιμοποιείται σε συνδυασμό με παραδοσιακές ανοσολογικές, μορφολογικές και βιοχημικές μελέτες. Οι μολυσματικές ασθένειες εξελίσσονται και αναπτύσσονται, όπως και η ίδια η ανθρωπότητα. Κάθε χρόνο υπάρχουν όλο και περισσότερα από αυτά, και γίνονται όλο και πιο δύσκολο να διαγνωστούν. Οι παράγοντες που προκαλούν την εμφάνιση ασθενειών και επηρεάζουν την ανάπτυξή τους προσαρμόζονται σταδιακά και στις γύρω εξωτερικές συνθήκες, αλλάζοντας μαζί τους. Αυτός ήταν ο λόγος που άρχισαν να εμφανίζονται νέες μέθοδοι και τεχνολογίες στην ιατρική που βοηθούν στην απόκτηση ακριβέστερων αποτελεσμάτων στη διάγνωση μιας συγκεκριμένης ασθένειας.

Αυτή η μέθοδος εργαστηριακής διάγνωσης μολυσματικών ασθενειών βασίζεται στην ανίχνευση του αιτιολογικού παράγοντα μιας λοίμωξης που υποπτεύεται ο γιατρός στο ερευνητικό υλικό. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης θα τα αναγνωρίσει, προσδιορίζοντας το αντίστοιχο γενετικό υλικό (RNA ή DNA) σε δείγματα που λαμβάνονται από τον ασθενή.

Η PCR εφευρέθηκε από τον Αμερικανό επιστήμονα Kary Mullis το 1983.

Οι περισσότερες λοιμώξεις, εάν εντοπιστούν έγκαιρα, είναι εξαιρετικά θεραπεύσιμες. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο η μέθοδος PCR είναι τόσο αποτελεσματική, επειδή είναι σε θέση να ανιχνεύσει ακόμη και ιούς ή βακτήρια των οποίων τα κύτταρα είναι μεμονωμένα στο υλικό. Επιπλέον, μια τέτοια διάγνωση προσδιορίζει τον ιό, καθορίζει τη φύση της εμφάνισής του, τη δύναμη με την οποία επηρεάζει το σώμα, ακόμη και τον αριθμό των μικροβίων στο σώμα του ασθενούς. Ο γιατρός θα μπορεί να χρησιμοποιήσει όλες τις πληροφορίες που λαμβάνονται με τη μέθοδο της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης για να επιλέξει τα κατάλληλα φάρμακα και να συνταγογραφήσει την κατάλληλη θεραπεία.

Έρευνα PCR

Σύμφωνα με την ίδια την αρχή της λειτουργίας, όλα συμβαίνουν πολύ απλά. Το βιολογικό υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή τοποθετείται σε ειδικό αντιδραστήρα. Στη συνέχεια προστίθενται εκεί συγκεκριμένα ένζυμα που μπορούν να έρθουν σε επαφή με το DNA του μικροβίου που υπάρχει στο υλικό και να συνθέσουν το αντίγραφό του.

Η αντιγραφή βασίζεται στην αρχή της αλυσιδωτής αντίδρασης. Δηλαδή, η όλη διαδικασία θα απαιτήσει πολλά στάδια. Πρώτα, 1 μόριο DNA σχηματίζει 2 νέα μόρια, στη συνέχεια δημιουργούνται 4 νέα από αυτά και ούτω καθεξής έως και εκατοντάδες και χιλιάδες αντίγραφα. Μετά από αυτό, θα πραγματοποιηθεί η ανάλυση και η αποκωδικοποίηση.

Θραύσματα μικροβιακού DNA μπορούν να περιέχονται σε διάφορα βιολογικά υλικά:

σε βιολογικά υγρά (σάλιο, αρθρικό υγρό, αμνιακό υγρό, υπεζωκοτικό υγρό, εγκεφαλονωτιαίο υγρό, χυμός προστάτη).
στο αίμα και στον ορό, στο πλάσμα.
στην απόξεση των επιθηλιακών κυττάρων (απόξεση από τον αυχενικό σωλήνα, από την ουρήθρα - τόσο για γυναίκες όσο και για άνδρες).
στα ούρα (τα πρωινά ούρα, συγκεκριμένα το πρώτο τους τμήμα, θα απαιτηθούν για ανάλυση).
στα πτύελα?
σε βλέννα και άλλες βιολογικές εκκρίσεις.
σε βιοπάθειες του στομάχου και του δωδεκαδακτύλου.

Ποιες ασθένειες μπορούν να ανιχνευθούν με PCR;

Οι γιατροί θεωρούν αυτόν τον τύπο διάγνωσης ως έναν από τους πιο ακριβείς. Αυτή η μελέτη μας επιτρέπει να ανιχνεύσουμε σχεδόν όλες τις ιογενείς ασθένειες που είναι επί του παρόντος γνωστές στην ιατρική. Μια πολύ σημαντική πτυχή είναι ότι ανάμεσά τους υπάρχουν λοιμώξεις που ζουν στον ανθρώπινο οργανισμό για πολλά χρόνια, χωρίς να εκδηλώνονται με κανέναν τρόπο. Απλώς μεγαλώνουν προσδοκώντας πότε θα τους είναι πιο άνετο να εκδηλωθούν (μειωμένη ανοσία, εξάντληση του σώματος κ.λπ.). Η ανίχνευση τέτοιων λανθάνοντων λοιμώξεων είναι ιδιαίτερα σημαντική στην ουρολογική και γυναικολογική περιοχή.

Ακολουθούν ορισμένες ασθένειες για τις οποίες πραγματοποιείται συχνά ανάλυση αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης:

ηπατίτιδα Β και C;
πολλές ασθένειες που μεταδίδονται σεξουαλικά (διάγνωση χλαμυδίων, ουρεαπλάσμωση, μυκοπλάσμωση, καντιντίαση των γεννητικών οργάνων, βακτηριακή κολπίτιδα, τριχομονάση, λοιμώδης μονοπυρήνωση, λοίμωξη από ιό θηλώματος (HPV), AIDS, κ.λπ.).
λοίμωξη από έρπητα (συμπεριλαμβανομένου του έρπητα των γεννητικών οργάνων).
φυματίωση και ελικοβακτηρίωση.

Η μέθοδος PCR δίνει καλά αποτελέσματα γιατί οι περισσότερες από αυτές τις ασθένειες χαρακτηρίζονται από το γεγονός ότι τα συμπτώματά τους (ειδικά σε πρώιμο στάδιο) δεν είναι ιδιαίτερα αισθητά. Όμως οι συνέπειες που έχουν στον οργανισμό είναι πολύ αρνητικές και συχνά πολύ επικίνδυνες για την υγεία, ακόμη και τη ζωή.

Για παράδειγμα, τα σεξουαλικά μεταδιδόμενα νοσήματα μπορούν να αυξήσουν σημαντικά τον κίνδυνο καρκίνου του τραχήλου της μήτρας στις γυναίκες, να επηρεάσουν αρνητικά την εγκυμοσύνη ή να προκαλέσουν στειρότητα. Επιπλέον, η υγεία του αγέννητου μωρού της εξαρτάται από την υγεία της μητέρας. Ως εκ τούτου, είναι πολύ σημαντικό, με την παραμικρή υποψία κρυφών λοιμώξεων, να δίνεται έγκαιρα αίμα για διάγνωση, ώστε να αποφευχθεί η μόλυνση του εμβρύου μέσω της διείσδυσης παθογόνων μικροοργανισμών. Για τους άνδρες, οι συνέπειες δεν είναι λιγότερο αρνητικές: μειωμένη κινητικότητα και βιωσιμότητα του σπέρματος, ανάπτυξη ανδρικής υπογονιμότητας και προστατίτιδας, βλάβη στην ουρήθρα κ.λπ.

Μια τέτοια ανάλυση είναι επίσης πολύ σημαντική για την έγκαιρη ανίχνευση ιογενούς ηπατίτιδας, φυματίωσης και διαφόρων εντερικών λοιμώξεων. Όταν απαιτείται άμεση θεραπεία, είναι πολύ σημαντικό να κατανοήσουμε ποιο παθογόνο έχει επηρεάσει τον οργανισμό και τι πρέπει να αντιμετωπιστεί. Το αίμα του ασθενούς ή οποιοδήποτε άλλο βιολογικό υλικό θα βοηθήσει στη διεξαγωγή μιας πλήρους και σωστής διάγνωσης και θα συνταγογραφήσει θεραπεία που θα βοηθήσει γρήγορα στην αποκατάσταση των λειτουργιών του σώματος και θα προωθήσει την ανάρρωση.

Ο έρπης είναι επίσης εξαιρετικά επίμονος και επικίνδυνος. Από μια ανενεργή λειτουργία, μπορεί εύκολα να μετατραπεί σε προοδευτική, επηρεάζοντας το κεντρικό νευρικό σύστημα, επηρεάζοντας την εμφάνιση και την ανάπτυξη τέτοιων τρομερών ασθενειών όπως η μηνιγγίτιδα και η εγκεφαλίτιδα.

Μεταγραφή ανάλυσης

Μετά τη διεξαγωγή της μελέτης, μπορεί να λάβετε είτε θετικό είτε αρνητικό αποτέλεσμα. Είναι θετικά αποτελέσματα που θα υποδεικνύουν ότι αυτή ή εκείνη η μόλυνση υπάρχει στο σώμα σας. Ένα αρνητικό αποτέλεσμα σημαίνει ότι δεν υπάρχει υποψία μόλυνσης στο σώμα του ασθενούς. Δηλαδή δεν βρέθηκε τίποτα στο βιολογικό υλικό που υποβλήθηκε για έρευνα.

Τυχόν δείκτες πρέπει να αποκρυπτογραφηθούν και να σας ανακοινωθούν από γιατρό. Μην αναστατώνεστε ή φοβάστε τα άσχημα αποτελέσματα, επειδή η αντίδραση αποκάλυψε την ασθένεια, πράγμα που σημαίνει ότι μετά από πρόσθετες εξετάσεις ο γιατρός θα μπορεί να συνταγογραφήσει πλήρη θεραπεία. Το κύριο πράγμα δεν είναι να κάνετε αυτοθεραπεία και να μην καθυστερήσετε τη διαδικασία.

Προετοιμασία για ανάλυση: τι πρέπει να γνωρίζετε;

Η ανίχνευση διαφορετικών ασθενειών θα απαιτήσει διαφορετικά βιολογικά υλικά. Πριν κάνετε PCR, φροντίστε να συμβουλευτείτε έναν κατάλληλο ειδικό και να προετοιμαστείτε προσεκτικά για την επερχόμενη διαδικασία.

Για να γίνει αυτό, θα πρέπει να ακολουθήσετε αυστηρά όλες τις συστάσεις και τις οδηγίες του γιατρού σας. Θυμηθείτε ότι το αίμα λαμβάνεται συνήθως με άδειο στομάχι. Για να πάρετε ένα επίχρισμα από τον κόλπο ή την ουρήθρα, πρέπει να απέχετε από τη σεξουαλική επαφή για 1-2 ημέρες, να κάνετε όλη την απαραίτητη υγιεινή των γεννητικών οργάνων το βράδυ και να ξεπλύνετε μόνο με ζεστό νερό το πρωί. Είναι επίσης σημαντικό να διακόψετε τη λήψη φαρμάκων για περίπου μία εβδομάδα, εκτός εάν σας υποδείξει ο γιατρός σας. Και για 2-3 ώρες πριν κάνετε το τεστ, μην ουρείτε. Για τις γυναίκες, αξίζει να ληφθεί υπόψη ότι ο βέλτιστος χρόνος για τη διεξαγωγή της μελέτης είναι λίγες ημέρες πριν ή αμέσως μετά την έμμηνο ρύση.

Μέθοδος PCR: κύρια πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα

Αυτός ο τύπος διάγνωσης έχει πολλά πλεονεκτήματα.

Πρώτον, τυχόν παθογόνοι παράγοντες μολυσματικών ασθενειών προσδιορίζονται με άμεση ένδειξη τους, σε αντίθεση με άλλες παραδοσιακές εργαστηριακές εξετάσεις.

Δεύτερον, αυτή η ανάλυση είναι απλώς καθολική, επειδή σχεδόν όλα τα βιολογικά υλικά είναι διαθέσιμα για την υλοποίησή της, τα οποία συχνά δεν είναι αποδεκτά για καμία άλλη ερευνητική μέθοδο.

Ένα πολύ σημαντικό σημείο είναι ότι όταν πραγματοποιείται αυτή η διάγνωση, απομονώνεται ένα θραύσμα DNA στο υπό μελέτη υλικό, το οποίο θα είναι χαρακτηριστικό μόνο ενός συγκεκριμένου παθογόνου, δηλαδή ενός πολύ συγκεκριμένου ιού ή βακτηριδίου. Αυτό δείχνει πόσο συγκεκριμένη είναι αυτή η αντίδραση.

Ένα άλλο επιχείρημα υπέρ αυτής της διάγνωσης θα είναι η υψηλή ταχύτητα εκτέλεσής της. Εάν οποιεσδήποτε πολιτιστικές μελέτες απαιτούν όχι ημέρες, αλλά ακόμη και εβδομάδες απαραίτητες για την απομόνωση και την ανάπτυξη του παθογόνου σε κυτταρική καλλιέργεια, τότε αυτή η μέθοδος θα σας επιτρέψει να αποκτήσετε αποτελέσματα εντός 4-5 ωρών.

Η PCR καθιστά δυνατή την ανίχνευση όχι μόνο μιας λοίμωξης που βρίσκεται ήδη στην κορύφωση της νόσου, αλλά και χρόνιων ασθενειών, οποιωνδήποτε μεμονωμένων ιών ή βακτηρίων. Αυτή η διάγνωση είναι δυνατή λόγω της πολύ υψηλής ευαισθησίας της μεθόδου. Αυτό θα πρέπει επίσης να περιλαμβάνει το γεγονός ότι η μόλυνση θα ανιχνευθεί ακόμη και αν υπάρχει μόνο ένα κύτταρο συγκεκριμένου ιού ή βακτηρίου στο βιολογικό υλικό που υποβλήθηκε για ανάλυση.

Οι αντιδράσεις σε ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα είναι πολύ σπάνιες.

Είναι αλήθεια ότι η μέθοδος έχει και τα μειονεκτήματά της. Ένα από αυτά είναι η πιθανότητα λήψης ψευδώς θετικού αποτελέσματος. Αυτό συμβαίνει συχνά επειδή η λοίμωξη έχει ήδη σκοτωθεί, αλλά τα επιθηλιακά της κύτταρα δεν έχουν ανανεωθεί ακόμα, οπότε η αντίδραση θα εξακολουθεί να βλέπει τα νεκρά υπολείμματά της και να την κλωνοποιεί. Επομένως, θα πρέπει είτε να περιμένετε έως ότου απομακρυνθούν πλήρως τα νεκρά κύτταρα μόλυνσης από το σώμα (από ένα μήνα έως δύο μετά τη θεραπεία), είτε να χρησιμοποιήσετε άλλες μεθόδους σε πρώιμο στάδιο: σπορά ή καλλιέργεια. Αργότερα θα είναι δυνατός ο έλεγχος με χρήση PCR.

Μια άλλη αδυναμία της ανάλυσης είναι η μεταβλητότητα όλων των μικροοργανισμών. Αυτό σημαίνει ότι ορισμένοι γονότυποι παθογόνων που έχουν ήδη μεταλλαχθεί στο σώμα θα είναι αόριστοι στο σύστημα δοκιμής και δεν θα υπάρξει καμία αντίδραση. Για το σκοπό αυτό, γίνονται διάφορες εξελίξεις για τη βελτίωση αυτής της μεθόδου.

Ομοσπονδιακή Υπηρεσία για την Εκπαίδευση

Κρατικό εκπαιδευτικό ίδρυμα

Ανώτατη επαγγελματική εκπαίδευση

"Κρατική Παιδαγωγική Ακαδημία Καρελίας"

Εργασία μαθήματος με θέμα:

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και εφαρμογή της

Συμπλήρωσε: μαθήτρια Koryagina Valeria Aleksandrovna

Έλεγχος: Karpikova Natalya Mikhailovna

Petrozavodsk 2013

Εισαγωγή

Κεφάλαιο 1. Βιβλιογραφία

1.5.4 Εφέ οροπεδίου

1.5.6 Ενίσχυση

συμπέρασμα

Εισαγωγή

Τα τελευταία είκοσι χρόνια σημαδεύτηκαν από την ευρεία εισαγωγή των μεθόδων μοριακής γενετικής στις βιολογικές, ιατρικές και γεωργικές επιστήμες.

Στις αρχές της δεκαετίας του 1970, φαινόταν ότι η μοριακή βιολογία είχε φτάσει σε έναν ορισμένο βαθμό ωριμότητας. Την περίοδο αυτή, το κύριο αντικείμενο της μοριακής γενετικής έρευνας ήταν οι μικροοργανισμοί. Η μετάβαση στους ευκαρυώτες παρουσίασε στους ερευνητές εντελώς νέα προβλήματα που δεν μπορούσαν να λυθούν χρησιμοποιώντας τις μεθόδους γενετικής ανάλυσης που υπήρχαν εκείνη την εποχή. Μια σημαντική ανακάλυψη στην ανάπτυξη της μοριακής γενετικής έγινε δυνατή χάρη στην εμφάνιση ενός νέου πειραματικού εργαλείου - των ενδονουκλεασών περιορισμού. Τα επόμενα χρόνια, ο αριθμός των μεθόδων για άμεση ανάλυση DNA, που βασίστηκαν σε ποιοτικά διαφορετικές προσεγγίσεις, άρχισε να αυξάνεται ραγδαία.

Οι σύγχρονες τεχνολογίες σε πολλές περιπτώσεις κατέστησαν δυνατή την έναρξη της μελέτης της λεπτής δομικής και λειτουργικής οργάνωσης των πυρηνικών και εξωπυρηνικών γονιδιωμάτων διαφόρων οργανισμών σε βαθύτερο επίπεδο. Αυτό είχε ιδιαίτερη σημασία για την ανάπτυξη νέων μεθόδων για τη διάγνωση και τη θεραπεία διαφόρων ασθενειών. Εξίσου σημαντική ήταν η δυνατότητα χρήσης των επιτευγμάτων της μοριακής γενετικής στη βιολογία και την αναπαραγωγή του πληθυσμού για τον εντοπισμό και την ανάλυση της γενετικής μεταβλητότητας πληθυσμών, ποικιλιών και στελεχών, αναγνώριση και πιστοποίηση οικονομικά πολύτιμων ατόμων, δημιουργία γενετικά τροποποιημένων οργανισμών και επίλυση άλλων ζητημάτων.

Κάθε μέθοδος έχει τα δικά της πλεονεκτήματα και μειονεκτήματα. Δεν υπάρχει καθολική μέθοδος που θα μπορούσε να λύσει όλα τα προβλήματα που προκύπτουν. Επομένως, η επιλογή μιας συγκεκριμένης μεθόδου για την έρευνα που διεξάγεται είναι ένα από τα σημαντικότερα στάδια κάθε επιστημονικής εργασίας.

Κεφάλαιο 1. Βιβλιογραφία

1.1 Ιστορικό της ανακάλυψης της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Το 1983 ο Κ.Β. Οι Mullis et al. δημοσίευσαν και κατοχύρωσαν με δίπλωμα ευρεσιτεχνίας τη μέθοδο αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR), η οποία προοριζόταν να έχει βαθύ αντίκτυπο σε όλους τους τομείς έρευνας και εφαρμογής νουκλεϊκών οξέων. Η σημασία αυτής της μεθόδου για τη μοριακή βιολογία και τη γενετική αποδείχθηκε τόσο μεγάλη και προφανής που επτά χρόνια αργότερα ο συγγραφέας τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας.

Στην αρχή της χρήσης της μεθόδου, μετά από κάθε κύκλο θέρμανσης-ψύξης, ήταν απαραίτητο να προστεθεί DNA πολυμεράση στο μίγμα της αντίδρασης, αφού απενεργοποιήθηκε στην υψηλή θερμοκρασία που ήταν απαραίτητη για τον διαχωρισμό των κλώνων της έλικας του DNA. Η διαδικασία αντίδρασης ήταν σχετικά αναποτελεσματική και απαιτούσε πολύ χρόνο και ένζυμο. Το 1986, η μέθοδος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης βελτιώθηκε σημαντικά. Έχει προταθεί η χρήση DNA πολυμερασών από θερμόφιλα βακτήρια. Αυτά τα ένζυμα αποδείχθηκε ότι ήταν θερμοσταθερά και ήταν σε θέση να αντέξουν πολλούς κύκλους αντίδρασης. Η χρήση τους κατέστησε δυνατή την απλοποίηση και την αυτοματοποίηση της PCR. Μία από τις πρώτες θερμοσταθερές πολυμεράσες DNA απομονώθηκε από βακτήρια Thermus aquaticusκαι ονομάστηκε Taq- πολυμεράση.

Η ικανότητα ενίσχυσης οποιουδήποτε τμήματος DNA του οποίου η αλληλουχία νουκλεοτιδίων είναι γνωστή, και να ληφθεί σε ομοιογενή μορφή και παρασκευαστική ποσότητα μετά την ολοκλήρωση της PCR, καθιστά την PCR μια εναλλακτική μέθοδο για μοριακή κλωνοποίηση βραχέων θραυσμάτων DNA. Σε αυτή την περίπτωση, δεν χρειάζεται να χρησιμοποιηθούν πολύπλοκες μεθοδολογικές τεχνικές που χρησιμοποιούνται στη γενετική μηχανική κατά τη διάρκεια της συμβατικής κλωνοποίησης. Η ανάπτυξη της μεθόδου PCR έχει επεκτείνει σε μεγάλο βαθμό τις μεθοδολογικές δυνατότητες της μοριακής γενετικής και, ειδικότερα, της γενετικής μηχανικής, τόσο που έχει αλλάξει ριζικά και έχει ενισχύσει το επιστημονικό δυναμικό πολλών από τις περιοχές της.

1.2 Τύποι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

· Ένθετη PCR- χρησιμοποιείται για τη μείωση του αριθμού των υποπροϊόντων της αντίδρασης. Χρησιμοποιούνται δύο ζεύγη εκκινητών και διεξάγονται δύο διαδοχικές αντιδράσεις. Το δεύτερο ζεύγος εκκινητών ενισχύει μια περιοχή DNA εντός του προϊόντος της πρώτης αντίδρασης.

· Αντεστραμμένη PCR- χρησιμοποιείται όταν είναι γνωστή μόνο μια μικρή περιοχή εντός της επιθυμητής ακολουθίας. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν πρόκειται για τον προσδιορισμό γειτονικών αλληλουχιών μετά την εισαγωγή του DNA στο γονιδίωμα. Για τη διεξαγωγή ανεστραμμένης PCR, πραγματοποιείται μια σειρά τομών DNA με τη χρήση περιοριστικών ενζύμων<#"justify">αστάρι αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

· Ειδική για την ομάδα PCR- PCR για συγγενείς<#"center">1.3 Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Ανακαλύφθηκε στα μέσα της δεκαετίας του 1980, η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) μπορεί να πολλαπλασιάσει τον αριθμό των αντιγράφων ενός αρχικού δείγματος εκατομμύρια φορές μέσα σε λίγες ώρες. Κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου αντίδρασης, σχηματίζονται δύο αντίγραφα από το αρχικό μόριο. Κάθε ένα από τα συντιθέμενα αντίγραφα DNA μπορεί να χρησιμεύσει ως πρότυπο για τη σύνθεση νέων αντιγράφων DNA στον επόμενο κύκλο. Έτσι, η επαναλαμβανόμενη επανάληψη των κύκλων οδηγεί σε αύξηση του αριθμού των αντιγράφων στη γεωμετρική πρόοδο. Από τους υπολογισμούς προκύπτει ότι ακόμη και με 30 κύκλους, ο αριθμός των αντιγράφων του αρχικού μορίου θα είναι πάνω από 1 δισεκατομμύριο. Ακόμα κι αν λάβουμε υπόψη ότι δεν αντιγράφονται όλα τα amplicons κατά τη διάρκεια κάθε κύκλου, ο συνολικός αριθμός των αντιγράφων, παρά το γεγονός αυτό, είναι αρκετά μεγάλος αριθμός.

Κάθε κύκλος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) αποτελείται από τα ακόλουθα βήματα:

· Μετουσίωσης - Η αύξηση της θερμοκρασίας αναγκάζει το δίκλωνο μόριο DNA να ξετυλιχθεί και να χωριστεί σε δύο μονόκλωνα.

· Ανόπτηση - Η μείωση της θερμοκρασίας επιτρέπει στους εκκινητές να δεσμεύονται σε συμπληρωματικές περιοχές του μορίου DNA.

· Επιμήκυνση - Το ένζυμο DNA πολυμεράση συμπληρώνει τον συμπληρωματικό κλώνο.

Για την ενίσχυση ενός επιλεγμένου θραύσματος, χρησιμοποιούνται δύο ολιγονουκλεοτιδικοί εκκινητές (εναρκτήρες) που πλευρίζουν μια συγκεκριμένη περιοχή DNA. Προσανατολισμένα αστάρια 3 - τελειώνει το ένα προς το άλλο και προς την ακολουθία που πρέπει να ενισχυθεί. Η DNA πολυμεράση πραγματοποιεί τη σύνθεση (ολοκλήρωση) αλληλοσυμπληρωματικών αλυσίδων DNA, ξεκινώντας με εκκινητές. Κατά τη σύνθεση του DNA, οι εκκινητές ενσωματώνονται φυσικά στην αλυσίδα των νεοσυντιθεμένων μορίων DNA. Κάθε κλώνος ενός μορίου DNA που σχηματίζεται χρησιμοποιώντας έναν από τους εκκινητές μπορεί να χρησιμεύσει ως πρότυπο για τη σύνθεση ενός συμπληρωματικού κλώνου DNA χρησιμοποιώντας έναν άλλο εκκινητή.

1.4 Διεξαγωγή αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR)

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης πραγματοποιείται σε ειδικούς σωλήνες πολυπροπυλενίου με λεπτό τοίχωμα, συμβατό σε μέγεθος με τον θερμικό κυκλοποιητή (ενισχυτή) που χρησιμοποιείται - μια συσκευή που ελέγχει τα χαρακτηριστικά θερμοκρασίας και χρόνου των σταδίων της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR).

1.5 Αρχή της μεθόδου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια in vitro μέθοδος ενίσχυσης DNA που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA δισεκατομμύρια φορές μέσα σε λίγες ώρες. Η δυνατότητα απόκτησης ενός τεράστιου αριθμού αντιγράφων μιας αυστηρά καθορισμένης περιοχής του γονιδιώματος απλοποιεί σημαντικά τη μελέτη ενός υπάρχοντος δείγματος DNA.

Για να πραγματοποιηθεί μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, πρέπει να πληρούνται ορισμένες προϋποθέσεις:

1.5.1 Η παρουσία ενός αριθμού συστατικών στο μείγμα της αντίδρασης

Τα κύρια συστατικά του μίγματος της αντίδρασης (PCR) είναι: Tris-HCl, KCl, MgCl 2, ένα μείγμα τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (ATP, GTP, CTP, TTP), εκκινητών (ολιγονουκλεοτίδια), παρασκευή δείγματος DNA, θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA. Καθένα από τα συστατικά του μίγματος της αντίδρασης εμπλέκεται άμεσα στην αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) και η συγκέντρωση των αντιδραστηρίων επηρεάζει άμεσα την πορεία της ενίσχυσης.

· Tris-HCl - καθορίζει το pH του μείγματος αντίδρασης, δημιουργεί μια ρυθμιστική ικανότητα. Η δραστηριότητα της DNA πολυμεράσης εξαρτάται από το pH του περιβάλλοντος, επομένως η τιμή του pH επηρεάζει άμεσα την πορεία της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Τυπικά η τιμή του pH είναι μεταξύ 8 και 9,5. Η υψηλή τιμή pH λαμβάνεται επειδή το pH του ρυθμιστικού διαλύματος Tril-HCl πέφτει καθώς αυξάνεται η θερμοκρασία.

· KCl - Η συγκέντρωση χλωριούχου καλίου έως 50 mM επηρεάζει την πορεία της μετουσίωσης και οι συγκεντρώσεις ανόπτησης πάνω από 50 mM αναστέλλουν την πολυμεράση του DNA.

· MgCl 2- αφού η DNA πολυμεράση είναι Mg 2+- εξαρτώμενο ένζυμο, τότε η συγκέντρωση των ιόντων μαγνησίου επηρεάζει τη δραστηριότητα του ενζύμου (Mg 2+σχηματίζει σύμπλοκα με NTP - αυτά τα σύμπλοκα είναι το υπόστρωμα για την πολυμεράση). Μια υψηλή συγκέντρωση οδηγεί σε αύξηση της μη ειδικής ενίσχυσης και μια χαμηλή συγκέντρωση οδηγεί σε αναστολή της αντίδρασης η βέλτιστη (για διάφορες πολυμεράσες) είναι στην περιοχή 0,5 - 5 mM. Επιπλέον, η συγκέντρωση των αλάτων μαγνησίου επηρεάζει την πορεία της μετουσίωσης και των διαδικασιών ανόπτησης - μια αύξηση στη συγκέντρωση του Mg 2+προκαλεί αύξηση στη θερμοκρασία τήξης του DNA (δηλαδή, τη θερμοκρασία στην οποία το 50% των δίκλωνων κλώνων DNA διαχωρίζονται σε μονόκλωνους).

· Τα NTP - τριφωσφορικά νουκλεοτίδια είναι άμεσα μονομερή νουκλεϊκών οξέων. Για να αποφευχθεί ο τερματισμός της αλυσίδας, συνιστάται ίση αναλογία και των τεσσάρων τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων. Η χαμηλή συγκέντρωση αυτών των συστατικών στο μείγμα αντίδρασης αυξάνει την πιθανότητα σφαλμάτων κατά την κατασκευή μιας συμπληρωματικής αλυσίδας DNA.

· Αστάρια - Το πιο βέλτιστο είναι να χρησιμοποιείτε αστάρια με διαφορά θερμοκρασίας τήξης όχι μεγαλύτερη από 2 - 4 ο Γ. Μερικές φορές κατά τη μακροχρόνια αποθήκευση σε θερμοκρασία 4°C ο Γ, ή μετά από μεγάλο αριθμό κατάψυξης και απόψυξης, οι εκκινητές σχηματίζουν δευτερεύουσες δομές - διμερή, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα της PCR. Η εξάλειψη αυτού του προβλήματος καταλήγει στην επώαση σε λουτρό νερού (T=95 ο Γ) για 3 λεπτά και στη συνέχεια ταχεία ψύξη στους 0o ΜΕ.

· Παρασκευάσματα DNA - η ποσότητα και η ποιότητα του παρασκευάσματος DNA (μήτρας) επηρεάζει άμεσα την πορεία και τις παραμέτρους της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Υπερβολικές ποσότητες δείγματος DNA αναστέλλουν την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR). Οι ακαθαρσίες διαφόρων ουσιών που βρίσκονται στο παρασκεύασμα DNA μπορούν επίσης να μειώσουν την αποτελεσματικότητα της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR): οξικό νάτριο, χλωριούχο νάτριο, ισοπροπανόλη, αιθανόλη, ηπαρίνη, φαινόλη, ουρία, αιμοσφαιρίνη κ.λπ.

· DNA πολυμεράση - όταν χρησιμοποιείται μικρή ποσότητα DNA πολυμεράσης, παρατηρείται μείωση στη σύνθεση του τελικού προϊόντος σε ευθεία αναλογία με το μέγεθος των θραυσμάτων. Μια περίσσεια πολυμεράσης κατά 2 - 4 φορές οδηγεί στην εμφάνιση διάχυτων φασμάτων και κατά 4 - 16 φορές - χαμηλού μοριακού βάρους μη ειδικά φασμάτων. Το εύρος των χρησιμοποιούμενων συγκεντρώσεων είναι 0,5 - 1,5 μονάδες δραστικότητας ανά 25 μl μίγματος PCR.

Εκτός από τα κύρια συστατικά του μείγματος PCR, χρησιμοποιείται ένας αριθμός πρόσθετων ουσιών που βελτιώνουν τους ποιοτικούς και ποσοτικούς δείκτες της PCR: ακεταμίδιο (5%) - αυξάνει τη διαλυτότητα των κύριων συστατικών. βεταΐνη (άλας νατρίου) - σταθεροποίηση της πολυμεράσης DNA, μείωση της θερμοκρασίας τήξης του DNA, εξισορρόπηση της θερμοκρασίας τήξης. αλβουμίνη βοοειδών (10-100 μg/ml) - σταθεροποίηση της DNA πολυμεράσης. διμεθυλοσουλφοξείδιο (1-10%) - αύξηση της διαλυτότητας των κύριων συστατικών. φορμαμίδη (2-10%) - αύξηση της ειδικότητας της ανόπτησης. γλυκερίνη (15-20%) - αύξηση της θερμικής σταθερότητας του ενζύμου, μείωση της θερμοκρασίας μετουσίωσης του δείγματος DNA. θειικό αμμώνιο - μείωση της θερμοκρασίας μετουσίωσης και ανόπτησης.

1.5.2 Κυκλική και θερμοκρασία λειτουργίας

Η γενική εμφάνιση ενός προγράμματος αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR) είναι η εξής:

στάδιο. Μακροχρόνια πρωτογενής μετουσίωση του σκευάσματος DNA

στάδιο. Ταχεία μετουσίωση της προετοιμασίας του DNA. Ανόπτηση ασταριών. Επιμήκυνση.30 - 45 κύκλοι.

στάδιο. Μεγάλη επιμήκυνση. Ψύξη του μείγματος αντίδρασης 1ος κύκλος.

Κάθε στοιχείο του σταδίου - μετουσίωση, ανόπτηση, επιμήκυνση - έχει ατομικά χαρακτηριστικά θερμοκρασίας και χρόνου. Οι παράμετροι θερμοκρασίας και χρόνου για κάθε στοιχείο επιλέγονται εμπειρικά, σύμφωνα με τους ποιοτικούς και ποσοτικούς δείκτες των προϊόντων ενίσχυσης.

Μετουσίωσης. Κατά τη διάρκεια αυτού του στοιχείου της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης, ένα δίκλωνο μόριο DNA χωρίζεται σε δύο μονόκλωνα. Οι παράμετροι θερμοκρασίας μετουσίωσης είναι στην περιοχή από 90 - 95 ο C, αλλά στην περίπτωση δείγματος DNA με υψηλή περιεκτικότητα σε γουανίνη και κυτοσίνη, η θερμοκρασία θα πρέπει να αυξηθεί στους 98 ο Γ. Η θερμοκρασία μετουσίωσης πρέπει να είναι επαρκής για την πλήρη μετουσίωση των κλώνων DNA και την αποφυγή «ψύξης με φλας» ή ταχείας ανόπτησης, ωστόσο, η θερμοσταθερή πολυμεράση DNA είναι λιγότερο σταθερή σε υψηλές θερμοκρασίες. Έτσι, η επιλογή των βέλτιστων παραμέτρων θερμοκρασίας μετουσίωσης για την αναλογία εκκινητή/δείγμα (παρασκευή DNA) είναι μια σημαντική προϋπόθεση κατά την εκτέλεση της ενίσχυσης. Εάν η θερμοκρασία μετουσίωσης στο πρώτο στάδιο είναι πάνω από 95 ο Γ, συνιστάται η προσθήκη DNA πολυμεράσης στο μείγμα αντίδρασης μετά την αρχική μετουσίωση. Η διάρκεια αυτού του στοιχείου του σταδίου κατά την αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) θα πρέπει να είναι επαρκής για την πλήρη μετουσίωση του DNA, αλλά ταυτόχρονα να μην έχει σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα της DNA πολυμεράσης σε μια δεδομένη θερμοκρασία.

Ανόπτηση. Θερμοκρασία ανόπτησης (Τ ΕΝΑ ) είναι μια από τις πιο σημαντικές παραμέτρους της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης. Η θερμοκρασία ανόπτησης για κάθε συγκεκριμένο αστάρι επιλέγεται ξεχωριστά. Εξαρτάται από το μήκος και τη νουκλεοτιδική σύνθεση του εκκινητή. Συνήθως είναι χαμηλότερο κατά 2 - 4 ο Από την τιμή του σημείου τήξης (Τ Μ ) αστάρι. Εάν η θερμοκρασία ανόπτησης του συστήματος είναι χαμηλότερη από τη βέλτιστη, τότε ο αριθμός των μη ειδικών ενισχυμένων θραυσμάτων αυξάνεται και, αντιστρόφως, μια υψηλότερη θερμοκρασία μειώνει τον αριθμό των ενισχυμένων προϊόντων. Σε αυτή την περίπτωση, η συγκέντρωση συγκεκριμένων αμπλικονίων μπορεί να μειωθεί απότομα, μέχρι την αναστολή της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης (PCR). Η αύξηση του χρόνου ανόπτησης οδηγεί επίσης σε αύξηση του αριθμού των μη ειδικών αμπλικονίων.

Επιμήκυνση. Τυπικά, κάθε τύπος θερμοσταθερής πολυμεράσης DNA έχει μια ατομική βέλτιστη θερμοκρασία για δραστηριότητα. Ο ρυθμός σύνθεσης του συμπληρωματικού κλώνου DNA από το ένζυμο είναι επίσης ειδικός για κάθε πολυμεράση (κατά μέσο όρο είναι 30 - 60 νουκλεοτίδια ανά δευτερόλεπτο ή 1 - 2 χιλιάδες βάσεις ανά λεπτό), επομένως ο χρόνος επιμήκυνσης επιλέγεται ανάλογα με τον τύπο της DNA πολυμεράσης και το μήκος της ενισχυμένης περιοχής.

1.5.3 Βασικές αρχές επιλογής ασταριών

Κατά τη δημιουργία ενός συστήματος δοκιμής PCR, ένα από τα κύρια καθήκοντα είναι η σωστή επιλογή εκκινητών, τα οποία πρέπει να πληρούν μια σειρά από κριτήρια:

Τα αστάρια πρέπει να είναι συγκεκριμένα. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στο 3 - άκρα των εκκινητών, επειδή από αυτά αρχίζει η πολυμεράση Taq να συμπληρώνει τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA. Εάν η εξειδίκευσή τους είναι ανεπαρκής, τότε είναι πιθανό να εμφανιστούν ανεπιθύμητες διεργασίες στον δοκιμαστικό σωλήνα με το μείγμα αντίδρασης, δηλαδή η σύνθεση μη ειδικού DNA (μικρών ή μεγάλων θραυσμάτων). Είναι ορατό στην ηλεκτροφόρηση με τη μορφή βαριών ή ελαφρών πρόσθετων ζωνών. Αυτό παρεμβαίνει στην αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης, καθώς είναι εύκολο να συγχέουμε ένα συγκεκριμένο προϊόν ενίσχυσης με συντιθέμενο ξένο DNA. Ορισμένοι εκκινητές και dNTP καταναλώνονται για τη σύνθεση μη ειδικού DNA, γεγονός που οδηγεί σε σημαντική απώλεια ευαισθησίας.

Τα αστάρια δεν πρέπει να σχηματίζουν διμερή και βρόχους, δηλ. δεν πρέπει να σχηματίζονται σταθεροί διπλοί κλώνοι ως αποτέλεσμα της ανόπτησης των ασταριών μεταξύ τους ή μεταξύ τους.

1.5.4 Εφέ οροπεδίου

Θα πρέπει να σημειωθεί ότι η διαδικασία συσσώρευσης συγκεκριμένων προϊόντων ενίσχυσης σε μια γεωμετρική πρόοδο διαρκεί μόνο για περιορισμένο χρονικό διάστημα και στη συνέχεια η απόδοσή της πέφτει κρίσιμα. Αυτό οφείλεται στο λεγόμενο φαινόμενο του οροπεδίου.

Εφέ όρου οροπέδιο χρησιμοποιείται για να περιγράψει τη διαδικασία συσσώρευσης προϊόντων PCR στους τελευταίους κύκλους ενίσχυσης.

Ανάλογα με τις συνθήκες και τον αριθμό των κύκλων της αντίδρασης ενίσχυσης, τη στιγμή που επιτυγχάνεται το αποτέλεσμα οροπέδιο επηρεάζονται από τη χρήση υποστρωμάτων (dNTP και εκκινητές), τη σταθερότητα των αντιδρώντων (dNTPs και ένζυμο), την ποσότητα των αναστολέων, συμπεριλαμβανομένων των πυροφωσφορικών και των διπλών DNA, τον ανταγωνισμό για τα αντιδρώντα από μη ειδικά προϊόντα ή διμερή εκκινητών, τη συγκέντρωση ενός συγκεκριμένου προϊόντος και ατελής μετουσίωση σε υψηλές συγκεντρώσεις προϊόντων ενίσχυσης.

Όσο χαμηλότερη είναι η αρχική συγκέντρωση του DNA στόχου, τόσο μεγαλύτερος είναι ο κίνδυνος να αποτύχει η αντίδραση. Αυτό το σημείο μπορεί να προκύψει προτού υπάρχουν αρκετά ειδικά προϊόντα ενίσχυσης προς ανάλυση. Μόνο καλά βελτιστοποιημένα συστήματα δοκιμών μπορούν να το αποφύγουν.

1.5.5 Προετοιμασία βιολογικού δείγματος

Για την απομόνωση του DNA, χρησιμοποιούνται διάφορες τεχνικές ανάλογα με τις εργασίες. Η ουσία τους έγκειται στην εξαγωγή (εξαγωγή) DNA από ένα βιολογικό παρασκεύασμα και την απομάκρυνση ή εξουδετέρωση ξένων ακαθαρσιών για να ληφθεί ένα παρασκεύασμα DNA με καθαρότητα κατάλληλη για PCR.

Η μέθοδος για τη λήψη ενός παρασκευάσματος καθαρού DNA που περιγράφεται από τη Marmur θεωρείται τυπική και έχει ήδη γίνει κλασική. Περιλαμβάνει ενζυματική πρωτεόλυση που ακολουθείται από αποπρωτεϊνοποίηση και επανακαταβύθιση του DNA με αλκοόλη. Αυτή η μέθοδος σας επιτρέπει να αποκτήσετε ένα καθαρό παρασκεύασμα DNA. Ωστόσο, είναι αρκετά απαιτητικό και περιλαμβάνει εργασία με τέτοιες επιθετικές και με έντονη οσμή ουσίες όπως η φαινόλη και το χλωροφόρμιο.

Μία από τις επί του παρόντος δημοφιλείς μεθόδους είναι η μέθοδος εξαγωγής DNA που προτείνεται από τους Boom et al. Αυτή η μέθοδος βασίζεται στη χρήση ενός ισχυρού χαοτροπικού παράγοντα, της θειοκυανικής γουανιδίνης (GuSCN), για τη λύση των κυττάρων και την επακόλουθη ρόφηση του DNA σε έναν φορέα (γυάλινες χάντρες, γη διατόμων, γυάλινο γάλα κ.λπ.). Μετά το πλύσιμο, το DNA παραμένει στο δείγμα, απορροφημένο στον φορέα, από τον οποίο αφαιρείται εύκολα χρησιμοποιώντας ένα ρυθμιστικό διάλυμα έκλουσης. Η μέθοδος είναι βολική, τεχνολογικά προηγμένη και κατάλληλη για την προετοιμασία δείγματος για ενίσχυση. Ωστόσο, η απώλεια DNA είναι δυνατή λόγω μη αναστρέψιμης προσρόφησης στον φορέα, καθώς και κατά τη διάρκεια πολλών πλύσεων. Αυτό είναι ιδιαίτερα σημαντικό όταν εργάζεστε με μικρές ποσότητες DNA σε ένα δείγμα. Επιπλέον, ακόμη και ίχνη GuSCN μπορούν να αναστείλουν την PCR. Επομένως, κατά τη χρήση αυτής της μεθόδου, η σωστή επιλογή του ροφητικού και η προσεκτική τήρηση των τεχνολογικών αποχρώσεων είναι πολύ σημαντικές.

Μια άλλη ομάδα μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων βασίζεται στη χρήση ιονανταλλακτών τύπου Chilex, οι οποίοι, σε αντίθεση με το γυαλί, δεν απορροφούν το DNA, αλλά μάλλον ακαθαρσίες που παρεμβαίνουν στην αντίδραση. Κατά κανόνα, αυτή η τεχνολογία περιλαμβάνει δύο στάδια: βρασμό του δείγματος και ρόφηση ακαθαρσιών σε έναν εναλλάκτη ιόντων. Η μέθοδος είναι εξαιρετικά ελκυστική λόγω της απλότητας εκτέλεσής της. Στις περισσότερες περιπτώσεις είναι κατάλληλο για εργασία με κλινικό υλικό. Δυστυχώς, μερικές φορές υπάρχουν δείγματα με ακαθαρσίες που δεν μπορούν να αφαιρεθούν χρησιμοποιώντας εναλλάκτες ιόντων. Επιπλέον, ορισμένοι μικροοργανισμοί δεν μπορούν να καταστραφούν με απλό βράσιμο. Σε αυτές τις περιπτώσεις, είναι απαραίτητο να εισαχθούν πρόσθετα στάδια επεξεργασίας του δείγματος.

Επομένως, η επιλογή της μεθόδου προετοιμασίας του δείγματος θα πρέπει να λαμβάνεται υπόψη με την κατανόηση των σκοπών της επιδιωκόμενης ανάλυσης.

1.5.6 Ενίσχυση

Για να πραγματοποιηθεί η αντίδραση ενίσχυσης, είναι απαραίτητο να παρασκευαστεί ένα μείγμα αντίδρασης και να προστεθεί το αναλυθέν δείγμα DNA σε αυτό. Είναι σημαντικό να ληφθούν υπόψη ορισμένα χαρακτηριστικά της ανόπτησης ασταριού. Το γεγονός είναι ότι, κατά κανόνα, το αναλυόμενο βιολογικό δείγμα περιέχει διάφορα μόρια DNA, στα οποία οι εκκινητές που χρησιμοποιούνται στην αντίδραση έχουν μερική, και σε ορισμένες περιπτώσεις σημαντική, ομολογία. Επιπλέον, οι εκκινητές μπορούν να ανόπτονται μεταξύ τους, σχηματίζοντας διμερή εκκινητών. Και οι δύο οδηγούν σε σημαντική κατανάλωση εκκινητών για τη σύνθεση παραπροϊόντων (μη ειδικών) προϊόντων αντίδρασης και, ως αποτέλεσμα, μειώνουν σημαντικά την ευαισθησία του συστήματος. Αυτό καθιστά δύσκολη ή αδύνατη την ανάγνωση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης κατά την ηλεκτροφόρηση.

1.6 Σύνθεση του τυπικού μείγματος αντίδρασης PCR

x Ρυθμιστικό διάλυμα PCR (διάλυμα Tris-HCl 100 mM, pH 9,0, διάλυμα KCl 500 mM, διάλυμα MgCl2 25 mM ) …….2,5 µl

Νερό (MilliQ)……………………………………………………….18,8 µl

Μίγμα τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων (dNTPs)

mM διάλυμα κάθε……………………………………………….0,5 µl

Primer 1 (διάλυμα 10 mM) ………………………………………………………….….1 µl

Primer 2 (διάλυμα 10 mM) ………………………………………………………….….1 µl

DNA πολυμεράση (5 μονάδες/μl) ……………………………………… 0,2 μl

Δείγμα DNA (20 ng/µl) ……………………………………………..1 µl

1.7 Αξιολόγηση των αποτελεσμάτων της αντίδρασης

Για να αξιολογηθούν σωστά τα αποτελέσματα της PCR, είναι σημαντικό να κατανοήσουμε ότι αυτή η μέθοδος δεν είναι ποσοτική. Θεωρητικά, τα προϊόντα ενίσχυσης μορίων DNA μεμονωμένων στόχων μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση μετά από 30-35 κύκλους. Ωστόσο, στην πράξη, αυτό γίνεται μόνο σε περιπτώσεις που η αντίδραση λαμβάνει χώρα σε συνθήκες κοντά στο ιδανικό, κάτι που δεν συμβαίνει συχνά στη ζωή. Ο βαθμός καθαρότητας του παρασκευάσματος DNA έχει ιδιαίτερα μεγάλη επίδραση στην αποτελεσματικότητα της ενίσχυσης, δηλ. η παρουσία στο μείγμα αντίδρασης ορισμένων αναστολέων, από τους οποίους σε ορισμένες περιπτώσεις μπορεί να είναι εξαιρετικά δύσκολο να απαλλαγούμε. Μερικές φορές, λόγω της παρουσίας τους, ακόμη και δεκάδες χιλιάδες μόρια DNA στόχοι δεν μπορούν να ενισχυθούν. Έτσι, συχνά δεν υπάρχει άμεση σχέση μεταξύ της αρχικής ποσότητας του DNA στόχου και της τελικής ποσότητας προϊόντων ενίσχυσης.

Κεφάλαιο 2: Εφαρμογές της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης

Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς για δοκιμές και επιστημονικά πειράματα.

Ιατροδικαστική

Η PCR χρησιμοποιείται για τη σύγκριση των λεγόμενων «γενετικών δακτυλικών αποτυπωμάτων». Απαιτείται δείγμα γενετικού υλικού από τον τόπο του εγκλήματος - αίμα, σάλιο, σπέρμα, μαλλιά κ.λπ. Συγκρίνεται με το γενετικό υλικό του υπόπτου. Αρκεί πολύ μικρή ποσότητα DNA, θεωρητικά ένα αντίγραφο. Το DNA διασπάται σε θραύσματα και στη συνέχεια ενισχύεται χρησιμοποιώντας PCR. Τα θραύσματα διαχωρίζονται χρησιμοποιώντας ηλεκτροφόρηση DNA. Το προκύπτον μοτίβο της διάταξης των ζωνών DNA ονομάζεται γενετικό δακτυλικό αποτύπωμα.

Καθιέρωση της πατρότητας

Αποτελέσματα ηλεκτροφόρησης θραυσμάτων DNA που ενισχύθηκαν με PCR. Πατέρας. Παιδί. Μητέρα. Το παιδί κληρονόμησε ορισμένα χαρακτηριστικά του γενετικού αποτυπώματος και των δύο γονιών, με αποτέλεσμα ένα νέο, μοναδικό αποτύπωμα.

Αν και τα γενετικά δακτυλικά αποτυπώματα είναι μοναδικά, οι οικογενειακές σχέσεις μπορούν ακόμα να δημιουργηθούν κάνοντας πολλά δακτυλικά αποτυπώματα. Η ίδια μέθοδος μπορεί να εφαρμοστεί, ελαφρώς τροποποιημένη, για να εδραιωθεί η εξελικτική συγγένεια μεταξύ των οργανισμών.

Ιατρική διάγνωση

Η PCR καθιστά δυνατή τη σημαντική επιτάχυνση και διευκόλυνση της διάγνωσης κληρονομικών και ιογενών ασθενειών. Το γονίδιο ενδιαφέροντος ενισχύεται με PCR χρησιμοποιώντας κατάλληλους εκκινητές και στη συνέχεια προσδιορίζεται η αλληλουχία για την ταυτοποίηση μεταλλάξεων. Οι ιογενείς λοιμώξεις μπορούν να ανιχνευθούν αμέσως μετά τη μόλυνση, εβδομάδες ή μήνες πριν εμφανιστούν τα συμπτώματα.

Εξατομικευμένη ιατρική

Μερικές φορές τα φάρμακα αποδεικνύονται τοξικά ή αλλεργιογόνα για ορισμένους ασθενείς. Οι λόγοι για αυτό οφείλονται εν μέρει σε ατομικές διαφορές στην ευαισθησία και στο μεταβολισμό των φαρμάκων και των παραγώγων τους. Αυτές οι διαφορές καθορίζονται σε γενετικό επίπεδο. Για παράδειγμα, σε έναν ασθενή ένα συγκεκριμένο κυτόχρωμα μπορεί να είναι πιο ενεργό, σε έναν άλλο - λιγότερο. Προκειμένου να προσδιοριστεί ποιος τύπος κυτοχρώματος έχει ένας δεδομένος ασθενής, προτείνεται η διεξαγωγή ανάλυσης PCR πριν από τη χρήση του φαρμάκου. Αυτή η ανάλυση ονομάζεται προκαταρκτική γονότυπος.

Κλωνοποίηση γονιδίων

Η κλωνοποίηση γονιδίων είναι η διαδικασία απομόνωσης γονιδίων και, ως αποτέλεσμα χειρισμών γενετικής μηχανικής, απόκτησης μεγάλης ποσότητας του προϊόντος ενός δεδομένου γονιδίου. Η PCR χρησιμοποιείται για την ενίσχυση ενός γονιδίου, το οποίο στη συνέχεια εισάγεται σε έναν φορέα - ένα κομμάτι DNA που μεταφέρει ένα ξένο γονίδιο στον ίδιο ή σε άλλον οργανισμό κατάλληλο για ανάπτυξη. Για παράδειγμα, πλασμίδια ή ιικό DNA χρησιμοποιούνται ως φορείς. Η εισαγωγή γονιδίων σε έναν ξένο οργανισμό χρησιμοποιείται συνήθως για την παραγωγή του προϊόντος αυτού του γονιδίου - RNA ή, πιο συχνά, μιας πρωτεΐνης. Με αυτόν τον τρόπο λαμβάνονται πολλές πρωτεΐνες σε βιομηχανικές ποσότητες για χρήση στη γεωργία, την ιατρική κ.λπ.

Αλληλουχία DNA

Στη μέθοδο προσδιορισμού αλληλουχίας που χρησιμοποιεί διδεοξυνουκλεοτίδια σημασμένα με φθορίζουσα επισήμανση ή ραδιενεργό ισότοπο, η PCR είναι αναπόσπαστο μέρος, καθώς κατά τη διάρκεια του πολυμερισμού εισάγονται στην αλυσίδα του DNA παράγωγα νουκλεοτιδίων σημασμένων με φθορίζουσα ή ραδιενεργή επισήμανση. Αυτό σταματά την αντίδραση, επιτρέποντας τον προσδιορισμό των θέσεων συγκεκριμένων νουκλεοτιδίων μετά τον διαχωρισμό των συντιθέμενων αλυσίδων στο πήκτωμα.

Μεταλλαξιγένεση

Επί του παρόντος, η PCR έχει γίνει η κύρια μέθοδος για τη διεξαγωγή μεταλλαξιογένεσης. Η χρήση της PCR κατέστησε δυνατή την απλούστευση και την επιτάχυνση της διαδικασίας μεταλλαξιογένεσης, καθώς και να την καταστήσει πιο αξιόπιστη και αναπαραγώγιμη.

Η μέθοδος PCR κατέστησε δυνατή την ανάλυση της παρουσίας αλληλουχιών του ιού των ανθρώπινων θηλωμάτων σε τομές βιοψίας ενσωματωμένων σε παραφίνη όγκων ανθρώπινου τραχήλου της μήτρας 40 χρόνια πριν από αυτή τη μελέτη. Επιπλέον, χρησιμοποιώντας PCR, κατέστη δυνατό να ενισχυθούν και να κλωνοποιηθούν θραύσματα μιτοχονδριακού DNA από τα απολιθώματα ενός ανθρώπινου εγκεφάλου ηλικίας 7 χιλιάδων ετών!

Χρησιμοποιώντας προϊόντα λύσης μεμονωμένων ανθρώπινων σπερματοζωαρίων, αποδείχθηκε η ικανότητα ταυτόχρονης ανάλυσης δύο τόπων που βρίσκονται σε διαφορετικά μη ομόλογα χρωμοσώματα. Αυτή η προσέγγιση παρέχει μια μοναδική ευκαιρία για λεπτή γενετική ανάλυση και μελέτη χρωμοσωμικού ανασυνδυασμού, πολυμορφισμού DNA κ.λπ. Η μέθοδος ανάλυσης μεμονωμένων σπερματοζωαρίων βρήκε αμέσως πρακτική εφαρμογή στην ιατροδικαστική, καθώς ο τύπος HLA απλοειδών κυττάρων καθιστά δυνατό τον προσδιορισμό της πατρότητας ή την ταυτοποίηση εγκληματίας (το σύμπλεγμα HLA είναι ένα σύνολο γονιδίων του ανθρώπινου συμπλέγματος μείζονος ιστοσυμβατότητας· οι τόποι του συμπλέγματος HLA είναι οι πιο πολυμορφικοί από όλους τους γνωστούς στα ανώτερα σπονδυλωτά: μέσα σε ένα είδος, σε κάθε τόπο υπάρχει ένας ασυνήθιστα μεγάλος αριθμός διαφορετικών αλληλόμορφων - εναλλακτικές μορφές του ίδιου γονιδίου).

Χρησιμοποιώντας PCR, είναι δυνατό να προσδιοριστεί η σωστή ενσωμάτωση ξένων γενετικών δομών σε μια προκαθορισμένη περιοχή του γονιδιώματος των κυττάρων που μελετώνται. Το συνολικό κυτταρικό DNA συγκολλάται σε δύο ολιγονουκλεοτιδικούς εκκινητές, ο ένας από τους οποίους είναι συμπληρωματικός σε ένα τμήμα του DNA του ξενιστή κοντά στο σημείο εισαγωγής και ο άλλος στην αλληλουχία του ενσωματωμένου θραύσματος στον αντιπαράλληλο κλώνο DNA. Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, στην περίπτωση μιας αμετάβλητης δομής χρωμοσωμικού DNA στην προβλεπόμενη θέση εισαγωγής, οδηγεί στον σχηματισμό μονόκλωνων θραυσμάτων DNA άγνωστου μεγέθους και στην περίπτωση προγραμματισμένης εισαγωγής, δίκλωνων θραυσμάτων DNA ενός γνωστό μέγεθος, που προσδιορίζεται από την απόσταση μεταξύ των θέσεων ανόπτησης δύο εκκινητών. Επιπλέον, ο βαθμός ενίσχυσης της αναλυόμενης περιοχής γονιδιώματος στην πρώτη περίπτωση θα εξαρτάται γραμμικά από τον αριθμό των κύκλων και στη δεύτερη περίπτωση θα είναι εκθετικός. Η εκθετική συσσώρευση ενός ενισχυμένου θραύσματος προκαθορισμένου μεγέθους κατά τη διάρκεια της PCR μας επιτρέπει να το παρατηρήσουμε οπτικά μετά από ηλεκτροφορητική κλασμάτωση του παρασκευάσματος DNA και να βγάλουμε ένα σαφές συμπέρασμα σχετικά με την εισαγωγή μιας ξένης αλληλουχίας σε μια δεδομένη περιοχή χρωμοσωμικού DNA.

συμπέρασμα

Η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται σήμερα ευρύτερα ως μέθοδος για τη διάγνωση διαφόρων μολυσματικών ασθενειών. Η PCR σάς επιτρέπει να προσδιορίσετε την αιτιολογία μιας λοίμωξης ακόμα κι αν το δείγμα που λαμβάνεται για ανάλυση περιέχει μόνο λίγα μόρια DNA του παθογόνου. Η PCR χρησιμοποιείται ευρέως στην έγκαιρη διάγνωση λοιμώξεων από τον ιό HIV, ιογενούς ηπατίτιδας κ.λπ. Σήμερα δεν υπάρχει σχεδόν κανένας μολυσματικός παράγοντας που να μην μπορεί να ανιχνευθεί με PCR.

Κατάλογος χρησιμοποιημένης βιβλιογραφίας

1.Padutov V.E., Baranov O.Yu., Voropaev E.V. Μέθοδοι μοριακής γενετικής ανάλυσης. - Μν.: Unipol, 2007. - 176 σελ.

2.PCR "σε πραγματικό χρόνο" / Rebrikov D.V., Samatov G.A., Trofimov D.Yu. και τα λοιπά.; επεξεργάστηκε από δ.β. n. D.V. Ρεμπρίκοβα; πρόλογος ΛΑ. Όστερμαν και ακαδημαϊκός ΡΑΣ και ΡΑΑΣ Ε.Δ. Sverdlov; 2η έκδ., αναθ. και επιπλέον - Μ.: ΜΠΙΝΟΜ. Εργαστήριο Γνώσης, 2009. - 223 σελ.

.Patrushev L.I. Τεχνητά γενετικά συστήματα. - Μ.: Nauka, 2005. - Σε 2 τόμ.

.B. Glick, J. Pasternak Molecular biotechnology. Αρχές και Εφαρμογές 589 σελ., 2002

5.Shchelkunov S.N. Γενετική μηχανική. - Νοβοσιμπίρσκ: Sib. Παν. εκδοτικός οίκος, 2004. - 496 σελ.

Επιμέλεια Α.Α. Vorbyeva "Αλυσωτή αντίδραση πολυμεράσης και η εφαρμογή της για διαγνωστικά στη δερματοφλεβίτιδα"; Ιατρικό πρακτορείο ειδήσεων - 72 σελίδες

http://ru. wikipedia.org

http://scholar. google.ru

Http://www.med2000.ru/n1/n12. htm

12.http://prizvanie. su/ - ιατρικό περιοδικό

Φροντιστήριο

Χρειάζεστε βοήθεια για τη μελέτη ενός θέματος;

Οι ειδικοί μας θα συμβουλεύσουν ή θα παρέχουν υπηρεσίες διδασκαλίας σε θέματα που σας ενδιαφέρουν.
Υποβάλετε την αίτησή σαςυποδεικνύοντας το θέμα αυτή τη στιγμή για να ενημερωθείτε σχετικά με τη δυνατότητα λήψης μιας διαβούλευσης.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR)

Η ουσία της μεθόδου PCR. DNA πολυμεράση

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια πειραματική μέθοδος μοριακής βιολογίας που επιτρέπει σε κάποιον να επιτύχει σημαντική αύξηση σε μικρές συγκεντρώσεις ορισμένων θραυσμάτων νουκλεϊκού οξέος σε βιολογικό υλικό. Αυτή η διαδικασία αύξησης του αριθμού των αντιγράφων του DNA ονομάζεται ενίσχυση. Η αντιγραφή DNA κατά τη διάρκεια της PCR πραγματοποιείται από ένα ειδικό ένζυμο - πολυμεράση.Η DNA πολυμεράση (Εικ. 3) είναι ένα ένζυμο που εμπλέκεται στην αντιγραφή (ενίσχυση του DNA σε ζωντανούς οργανισμούς) του DNA. Ένζυμα αυτής της κατηγορίας καταλύουν τον πολυμερισμό δεοξυριβονουκλεοτιδίων κατά μήκος μιας αλυσίδας νουκλεοτιδίων DNA, τα οποία το ένζυμο «διαβάζει» και χρησιμοποιεί ως πρότυπο. Ο τύπος ενός νέου νουκλεοτιδίου καθορίζεται από την αρχή της συμπληρωματικότητας με το πρότυπο από το οποίο διαβάζεται.

Η DNA πολυμεράση προσθέτει ελεύθερα νουκλεοτίδια στο άκρο 3" της συναρμολογημένης αλυσίδας. Αυτό οδηγεί σε επιμήκυνση της αλυσίδας προς την κατεύθυνση 5"-3 Καμία από τις γνωστές πολυμεράσες DNA δεν είναι ικανή να δημιουργήσει μια αλυσίδα από την αρχή: μπορούν να προσθέσουν μόνο νουκλεοτίδια. σε ήδη υπάρχουσα 3"-υδροξυλομάδα. Για το λόγο αυτό, χρειάζεται DNA πολυμεράση αλφαβητάρι- μια σύντομη αλληλουχία νουκλεοτιδίων (συνήθως 20-25), συμπληρωματικά προς τα τερματικά τμήματα του γονιδίου που μελετάται - στα οποία θα μπορούσε να προσθέσει το πρώτο νουκλεοτίδιο. Οι εκκινητές αποτελούνται πάντα από βάσεις DNA και RNA, με τις δύο πρώτες βάσεις να είναι πάντα βάσεις RNA. Οι εκκινητές συντίθενται από ένα άλλο ένζυμο - primase. Ένα άλλο ένζυμο ελικάση- είναι απαραίτητο για το ξετύλιγμα της διπλής έλικας του DNA για να σχηματιστεί μια μονόκλωνη δομή, η οποία εξασφαλίζει την αντιγραφή και των δύο κλώνων σύμφωνα με το ημι-συντηρητικό μοντέλο αντιγραφής του DNA.

Ορισμένες πολυμεράσες DNA έχουν επίσης την ικανότητα να διορθώνουν σφάλματα στον πρόσφατα συναρμολογημένο κλώνο DNA. Εάν ανιχνευθεί ένα εσφαλμένο ζεύγος νουκλεοτιδίων, η πολυμεράση DNA κυλά ένα βήμα προς τα πίσω, εξαλείφει το εσφαλμένο νουκλεοτίδιο από την αλυσίδα και, στη συνέχεια, εισάγει το σωστό στη θέση του, και μετά η αναπαραγωγή συνεχίζεται ως συνήθως.

Διεξαγωγή PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μέθοδος ενίσχυσης DNA που μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την απομόνωση και τον πολλαπλασιασμό μιας συγκεκριμένης αλληλουχίας DNA δισεκατομμύρια φορές μέσα σε λίγες ώρες. Η δυνατότητα απόκτησης ενός τεράστιου αριθμού αντιγράφων μιας αυστηρά καθορισμένης περιοχής του γονιδιώματος απλοποιεί σημαντικά τη μελέτη ενός υπάρχοντος δείγματος DNA.

Για να πραγματοποιηθεί μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, πρέπει να πληρούνται ορισμένες προϋποθέσεις. Για να πραγματοποιηθεί PCR στην απλούστερη περίπτωση, απαιτούνται τα ακόλουθα στοιχεία:

Ένα πρότυπο DNA που περιέχει το τμήμα του DNA που πρέπει να ενισχυθεί.

Δύο εκκινητές συμπληρωματικοί προς τα άκρα του επιθυμητού θραύσματος. (Ζεύγος τεχνητά συντιθέμενων ολιγονουκλεοτιδίων, που συνήθως κυμαίνονται σε μέγεθος από 15 έως 30 bp, πανομοιότυπα με τα αντίστοιχα τμήματα του DNA στόχου. Παίζουν βασικό ρόλο στον σχηματισμό προϊόντων αντίδρασης ενίσχυσης. Οι σωστά επιλεγμένοι εκκινητές εξασφαλίζουν την ειδικότητα και την ευαισθησία του το σύστημα δοκιμής.)

Θερμοσταθερή πολυμεράση DNA. Η πολυμεράση που χρησιμοποιείται στην PCR πρέπει να παραμείνει ενεργή σε υψηλές θερμοκρασίες για μεγάλο χρονικό διάστημα, επομένως χρησιμοποιούνται ένζυμα που απομονώνονται από θερμόφιλα - Thermus aquaticus (Taq polymerase) και άλλα.

Τριφωσφορικά δεοξυνουκλεοτίδια (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).

Ιόντα Mg 2+ απαραίτητα για τη λειτουργία της πολυμεράσης.

Ένα ρυθμιστικό διάλυμα που παρέχει τις απαραίτητες συνθήκες αντίδρασης - pH, ιοντική ισχύς του διαλύματος. Περιέχει άλατα, αλβουμίνη ορού.

Για να αποφύγετε την εξάτμιση του μείγματος της αντίδρασης, προσθέστε λάδι υψηλής βρασμού, όπως βαζελίνη, στον δοκιμαστικό σωλήνα. Εάν χρησιμοποιείτε συσκευή με θερμαινόμενο καπάκι, αυτό δεν απαιτείται.

Η προσθήκη πυροφωσφατάσης μπορεί να αυξήσει την απόδοση της αντίδρασης PCR. Αυτό το ένζυμο καταλύει την υδρόλυση του πυροφωσφορικού, ενός υποπροϊόντος της προσθήκης τριφωσφορικών νουκλεοτιδίων στον αναπτυσσόμενο κλώνο DNA, σε ορθοφωσφορικό. Το πυροφωσφορικό μπορεί να αναστείλει την αντίδραση PCR.

Για να πολλαπλασιαστεί ο αριθμός των αντιγράφων του αρχικού DNA, απαιτείται μια κυκλική αντίδραση. Κατά κανόνα, κάθε ένας από τους διαδοχικά επαναλαμβανόμενους κύκλους PCR αποτελείται από τρία στάδια:

1. Μετουσίωσης, ή «τήξη» του DNA.Το εκμαγείο δίκλωνου DNA θερμαίνεται στους 94 - 96° C (ή στους 98° C εάν χρησιμοποιείται μια ιδιαίτερα θερμοσταθερή πολυμεράση) για 0,5 - 2 λεπτά έτσι ώστε οι κλώνοι του DNA να διαχωριστούν. Αυτό το στάδιο ονομάζεται μετουσίωση επειδή οι δεσμοί υδρογόνου μεταξύ των δύο κλώνων DNA έχουν σπάσει. Μερικές φορές, πριν από τον πρώτο κύκλο (πριν από την προσθήκη της πολυμεράσης), το μείγμα αντίδρασης προθερμαίνεται για 2 - 5 λεπτά για να μετουσιωθεί πλήρως η μήτρα και οι εκκινητές. Αυτή η τεχνική ονομάζεται ζεστό ξεκίνημα, σας επιτρέπει να μειώσετε την ποσότητα των μη ειδικών προϊόντων αντίδρασης.

2. Ανόπτηση - δέσμευση εκκινητών στο DNA εκμαγείου. Μόλις διαχωριστούν οι αλυσίδες, η θερμοκρασία μειώνεται αργά για να επιτρέψει στους εκκινητές να έρθουν σε επαφή με το μονόκλωνο πρότυπο. Η θερμοκρασία ανόπτησης εξαρτάται από τη σύνθεση των ασταριών και συνήθως επιλέγεται στους 50-65°C. Ο χρόνος σταδίου είναι 20 - 60 δευτερόλεπτα. Μια λανθασμένη επιλογή θερμοκρασίας ανόπτησης οδηγεί είτε σε κακή σύνδεση των ασταριών στο εκμαγείο (σε πολύ υψηλή θερμοκρασία) είτε σε δέσιμο σε λάθος μέρος και στην εμφάνιση μη ειδικών προϊόντων (σε πολύ χαμηλή θερμοκρασία).

3. Σύνθεση (επιμήκυνση αλυσίδας).Η DNA πολυμεράση αντιγράφει τον κλώνο του εκμαγείου χρησιμοποιώντας έναν εκκινητή ως εκκινητή. Η πολυμεράση ξεκινά τη σύνθεση του δεύτερου κλώνου από το άκρο 3" του ασταριού, το οποίο έχει συνδεθεί με το εκμαγείο και κινείται κατά μήκος του εκμαγείου. Η θερμοκρασία επιμήκυνσης εξαρτάται από την πολυμεράση. Οι πολυμεράσες Taq και Pfu που χρησιμοποιούνται συχνά είναι πιο δραστικές στους 72 Γ. Ο χρόνος σύνθεσης εξαρτάται από τον τύπο της πολυμεράσης του DNA και από το μήκος του ενισχυμένου θραύσματος Τυπικά, ο χρόνος επιμήκυνσης είναι ένα λεπτό ανά χίλια ζεύγη βάσεων, μετά την ολοκλήρωση όλων των κύκλων. εκτελούνται. τελική επιμήκυνση, για να συμπληρώσετε όλα τα μονόκλωνα θραύσματα. Αυτό το στάδιο διαρκεί 7 - 10 λεπτά.

Στη συνέχεια, τα στάδια της μετουσίωσης, της ανόπτησης και της επιμήκυνσης επαναλαμβάνονται πολλές φορές (30 ή περισσότερες φορές). Σε κάθε κύκλο, ο αριθμός των συντιθέμενων αντιγράφων ενός θραύσματος DNA διπλασιάζεται.

Όλες οι αντιδράσεις πραγματοποιούνται σε δοκιμαστικούς σωλήνες βυθισμένους σε θερμοστάτη. Η αλλαγή του καθεστώτος θερμοκρασίας και η διατήρησή του πραγματοποιείται αυτόματα.

Για να κατανοήσετε ακριβώς πώς ενισχύεται ένα συγκεκριμένο τμήμα DNA κατά τη διάρκεια της PCR, πρέπει να κατανοήσετε ξεκάθαρα τη θέση όλων των εκκινητών και των συμπληρωματικών τους αλληλουχιών στους ενισχυμένους κλώνους σε κάθε γύρο. Στον πρώτο γύρο, κάθε μία από τις νεοσυντιθέμενες αλυσίδες έχει πολύ μεγαλύτερο μήκος από την απόσταση από την 3"-υδροξυλική ομάδα του εκκινητή της έως το τερματικό νουκλεοτίδιο της αλληλουχίας συμπληρωματικής του δεύτερου εκκινητή. Τέτοιες αλυσίδες ονομάζονται "μακριές μήτρες". Πάνω σε αυτά θα γίνει περαιτέρω σύνθεση.

Στον δεύτερο γύρο, δίκλωνο DNA, αποτελούμενο από παρόμοιους και πρόσφατα συντεθειμένους (μακριού εκμαγείο) κλώνους, μετουσιώνεται και πάλι και στη συνέχεια ανόπτεται με εκκινητές. Κατά τη διάρκεια της σύνθεσης σε αυτόν τον γύρο, συντίθενται ξανά "μακριές μήτρες", καθώς και ένας αριθμός κλώνων με ένα αστάρι στο ένα άκρο και μια αλληλουχία συμπληρωματική του δεύτερου εκκινητή στο άλλο ("σύντομα πρότυπα"). Κατά τη διάρκεια του τρίτου γύρου, όλα τα ετεροδιπλά που σχηματίστηκαν νωρίτερα μετουσιώνονται ταυτόχρονα και ανόπτονται με εκκινητές και στη συνέχεια αντιγράφονται. Στους επόμενους γύρους, υπάρχουν όλο και περισσότεροι "μικροί πίνακες" και μέχρι τον 30ο γύρο ο αριθμός τους είναι ήδη 10 6 φορές μεγαλύτερος από τον αριθμό των αρχικών αλυσίδων ή "μακριών πινάκων".

Η ποσότητα του ειδικού προϊόντος αντίδρασης (περιορισμένη από εκκινητές) αυξάνεται θεωρητικά αναλογικά με το 2n, όπου n είναι ο αριθμός των κύκλων αντίδρασης. Στην πραγματικότητα, η απόδοση κάθε κύκλου μπορεί να είναι μικρότερη από 100%, οπότε στην πραγματικότητα:

όπου P είναι η ποσότητα του προϊόντος, E είναι η μέση απόδοση του κύκλου.

Ο αριθμός των «μακριών» αντιγράφων DNA αυξάνεται επίσης, αλλά γραμμικά, έτσι ένα συγκεκριμένο θραύσμα κυριαρχεί στα προϊόντα αντίδρασης. Η ανάπτυξη του απαιτούμενου προϊόντος περιορίζεται εκθετικά από τον αριθμό των αντιδραστηρίων, την παρουσία αναστολέων και τον σχηματισμό παραπροϊόντων.

Η PCR είναι μια εξαιρετικά ευαίσθητη μέθοδος, επομένως, εάν το δείγμα δοκιμής περιέχει έστω και ασήμαντη ποσότητα DNA που έχει περάσει κατά λάθος από το ένα μείγμα αντίδρασης στο άλλο, μπορούν να ληφθούν ψευδώς θετικά αποτελέσματα. Αυτό καθιστά απαραίτητο τον προσεκτικό έλεγχο όλων των διαλυμάτων και των γυαλικών που χρησιμοποιούνται για την PCR.

Βασικές αρχές επιλογής ασταριού.

1. Τα αστάρια πρέπει να είναι συγκεκριμένα. Ιδιαίτερη προσοχή δίνεται στα άκρα 3" των εκκινητών, καθώς από αυτά αρχίζει η πολυμεράση Taq να συμπληρώνει τη συμπληρωματική αλυσίδα DNA. Εάν η ειδικότητά τους είναι ανεπαρκής, τότε είναι πιθανό να εμφανιστούν ανεπιθύμητες διεργασίες στον δοκιμαστικό σωλήνα με το μείγμα αντίδρασης, δηλαδή, η σύνθεση μη ειδικού DNA (μικρά ή μακρά θραύσματα) Είναι ορατό στην ηλεκτροφόρηση με τη μορφή βαριών ή ελαφρών πρόσθετων ζωνών προϊόν ενίσχυσης με συντιθέμενο ξένο DNA, το οποίο οδηγεί στη σύνθεση μη ειδικού DNA σε σημαντική απώλεια ευαισθησίας.

2. Τα αστάρια δεν πρέπει να σχηματίζουν διμερή και βρόχους, δηλ. δεν πρέπει να σχηματίζονται σταθεροί διπλοί κλώνοι ως αποτέλεσμα της ανόπτησης των ασταριών μεταξύ τους ή μεταξύ τους.

Η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ή PCR χρησιμοποιείται στην εργαστηριακή διάγνωση των περισσότερων μολυσματικών ασθενειών. Σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών στο υπό μελέτη υλικό και έτσι να τους αναγνωρίσετε.

Τι είναι

Η μέθοδος αναπτύχθηκε το 1983 και το 1993 ο συγγραφέας της, Mullis, έλαβε το βραβείο Νόμπελ.

Βασικά στοιχεία της μεθόδου

Η ανάλυση PCR ανιχνεύει μοναδικό γενετικό υλικό στο υπό μελέτη υλικό, γεγονός που καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση του μικροοργανισμού.

Κάθε είδος μικροοργανισμού, φυτού ή ζώου έχει ένα μοναδικό σύνολο χρωμοσωμάτων. Σχηματίζονται από το DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ. Τα μικρά θραύσματα του DNA ονομάζονται νουκλεοτίδια και η συγκεκριμένη αλληλουχία τους αποτελεί ένα γονίδιο. Κάθε γονίδιο κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης, για παράδειγμα, κολλαγόνου, λευκωματίνης και όλων των άλλων. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία είναι μοναδική. Για κάθε είδος ζώντων οργανισμών, υπάρχουν κοινά τμήματα DNA που είναι υπεύθυνα για την ομοιομορφία εντός αυτού του είδους.

Η ανάλυση DNA πολλών εκατοντάδων μικροβίων που περιλαμβάνονται στο ερευνητικό υλικό δεν θα αποκαλύψει πρότυπα ειδών. Είναι απαραίτητο να πολλαπλασιαστεί ο αριθμός των σημαντικών γενετικών συστατικών, γεγονός που θα καταστήσει δυνατό τον εντοπισμό τους. Αυτό το πρόβλημα επιλύεται με τη μέθοδο PCR.

Η έρευνα αφορά το πεδίο της μοριακής βιολογίας. Η DNA πολυμεράση και τα ελεύθερα νουκλεοτίδια προστίθενται στο μικροβιακό DNA. Η πολυμεράση είναι ένα ένζυμο που εξασφαλίζει πολλαπλά αντίγραφα της επιθυμητής περιοχής από διαθέσιμα νουκλεοτίδια. Η διαδικασία ξεκινά με εκκινητές - βραχείς κλώνους ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) που συνδέονται στην αρχή του επιθυμητού γονιδίου.

Η διαδικασία ανάλυσης αποτελείται από πολλές φάσεις, καθεμία από τις οποίες απαιτεί συγκεκριμένο χρόνο και θερμοκρασία. Μέσα σε λίγες ώρες, η απαιτούμενη ποσότητα υλικού για ανάλυση λαμβάνεται από ένα χιλιοστό του γραμμαρίου βακτηριακού DNA. Ο σύγχρονος εξοπλισμός καθιστά δυνατή την επανειλημμένη αντιγραφή του DNA ακόμη και ενός κυττάρου, για παράδειγμα, ενός σπέρματος.

Πρόοδος της μελέτης

Βήματα ανάλυσης:

λήψη βιολογικού υλικού (αίμα, ούρα, κολπικές εκκρίσεις, σάλιο κ.λπ.) από τον ασθενή και παράδοση στο εργαστήριο.
διαχωρισμός δύο κλώνων DNA, η συνένωση των οποίων σχηματίζει ένα χρωμόσωμα και καθαρισμός τους από ξένες ακαθαρσίες.
διπλασιάζοντας το επιθυμητό τμήμα του κλώνου DNA, με αποτέλεσμα η ποσότητα του να αυξάνεται εκθετικά.
Επεξεργασία του προκύπτοντος υλικού με διαλύματα που προκαλούν ειδική φωταύγεια των θραυσμάτων DNA που προκύπτουν, αυτή η χρώση χρησιμοποιείται για την αναγνώριση του βακτηρίου ή του ιού στην πηγή. Η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό κλασμάτων DNA.

Η διάρκεια της ανάλυσης είναι 4-5 ώρες.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών μεθόδων αναγνώρισης μολυσματικών παραγόντων:

άμεσος προσδιορισμός των γονιδίων ενός μικροοργανισμού, σε αντίθεση με την ανίχνευση αντισωμάτων σε αυτόν σε πολλές άλλες μεθόδους ταυτοποίησης.
ειδικότητα, δηλαδή προσδιορισμός ενός συγκεκριμένου τύπου παθογόνου.
ευαισθησία: ακόμη και ένα κύτταρο ενός μικροοργανισμού είναι αρκετό για τη διάγνωση. γενικά, η απαιτούμενη ποσότητα παθογόνου είναι 10 φορές μικρότερη από ό,τι για άλλες μεθόδους.
η ευελιξία του βιοϋλικού - δεν εξετάζεται μόνο το αίμα, αλλά και τα πυκνά κύτταρα ιστών, οι ξύσεις από το επιθήλιο, οι βλεννώδεις εκκρίσεις και οποιοδήποτε άλλο περιβάλλον όπου μπορεί να υπάρχει μικρόβιο.
η ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων είναι αρκετές φορές υψηλότερη από ό,τι όταν χρησιμοποιείτε άλλες μεθόδους.
την ικανότητα αναγνώρισης χρόνιων, υποτονικών και λανθάνοντων λοιμώξεων.
απολύμανση υλικού που λαμβάνεται από ασθενή και πρόληψη μόλυνσης του προσωπικού του εργαστηρίου·
πλήρης αυτοματοποίηση της ερευνητικής διαδικασίας.

Μειονεκτήματα της ανάλυσης

Τα μειονεκτήματα της PCR σχετίζονται κυρίως με την τεχνική πολυπλοκότητά της:

είναι απαραίτητο να επιλέξετε τις σωστές αλληλουχίες RNA - εκκινητές και επίσης να προετοιμάσετε ένα μείγμα νουκλεοτιδίων για σύνθεση DNA.
η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, επομένως εάν υπάρχουν διαφορετικοί τύποι μικροβίων στο δείγμα, μπορεί να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα.
είναι απαραίτητο να καθαριστεί προσεκτικά το αναλυόμενο υλικό από ακαθαρσίες ανθρώπινων πρωτεϊνών και φαρμάκων, καθώς μειώνουν την ακρίβεια της διάγνωσης.
Η σύγκριση ελέγχου των αποτελεσμάτων με δείγματα που είναι γνωστό ότι περιέχουν ή δεν περιέχουν μικροβιακό υλικό, καθώς και χωρίς καθόλου DNA, απαιτείται για τον προσδιορισμό σφαλμάτων και μόλυνσης.

Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα PCR προκαλούνται από παραβίαση της τεχνικής ανάλυσης και αλλαγές στη γενετική αλληλουχία οποιουδήποτε από τα συστατικά της αντίδρασης. Εσφαλμένα θετικά δεδομένα εμφανίζονται επίσης όταν τα νουκλεοτίδια των εκκινητών και άλλων αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται συμπίπτουν κατά λάθος με ένα από τα γονίδια του μικροοργανισμού.

Η απομόνωση ενός μικροοργανισμού δεν δείχνει πάντα ότι ήταν η αιτία της νόσου. Υπάρχει ένα άλλο πρόβλημα κατά την ανάλυση του ανθρώπινου DNA: η γενετική βάση των περισσότερων ασθενειών είναι ακόμα άγνωστη, γεγονός που καθιστά αδύνατη τη διάγνωση μη μολυσματικών παθολογιών σε μικροβιολογικό επίπεδο. Αυτός ο τομέας της ιατρικής γενετικής αναπτύσσεται πολύ ενεργά.

Ενδείξεις για εξέταση PCR

Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα διαγνωστικά PCR χρησιμοποιούνται σε άτομα με μολυσματικές ασθένειες για τον προσδιορισμό του μικροοργανισμού που προκάλεσε τη νόσο.

Αυτή η ανάλυση χρησιμοποιείται στις ακόλουθες περιπτώσεις:

την ανάγκη ανίχνευσης και αναγνώρισης ιών, βακτηρίων, πρωτόζωων σε οποιεσδήποτε μολυσματικές ασθένειες όταν απαιτείται διαγνωστική ακρίβεια·
ταυτοποίηση ενός ατόμου σε σύγκριση με γενετικό υλικό γνωστής προέλευσης·
ανάλυση ιστών που λαμβάνονται με τεχνική λεπτής βελόνας, οι οποίοι είναι πολύ δύσκολο να εξεταστούν με άλλες μεθόδους.
διάγνωση λευχαιμίας και κακοήθων όγκων.
διεξαγωγή πειραμάτων με εμφύτευση εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε ζώα (απαγορεύεται η χρήση τέτοιων κυττάρων σε ανθρώπους), καθώς και σειρές αναπαραγωγής εργαστηριακών ποντικών με προκαθορισμένη γενετική ασθένεια.

Οι προοπτικές για τη χρήση της αντίδρασης PCR και οι παραλλαγές της στην ιατρική και τη βιολογία αιχμαλωτίζουν τη φαντασία - από τη δοκιμή νέων φαρμάκων σε επίπεδο γονιδίου έως τη δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών με συγκεκριμένες ιδιότητες. Εργασίες προς αυτή την κατεύθυνση γίνονται στα μεγαλύτερα εργαστήρια στον κόσμο, γεγονός που βοηθά στη βελτίωση της μεθόδου PCR σε εφαρμοσμένο επίπεδο για τη διάγνωση των ανθρώπινων λοιμωδών νοσημάτων.

Στην ιατρική, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται συνήθως για τη διάγνωση και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας για τις ακόλουθες ασθένειες:

ενδοκυτταρικές λοιμώξεις, για παράδειγμα, ή?
ασθένειες που μεταδίδονται μέσω της σεξουαλικής επαφής·
Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού και πολλά άλλα.

Προετοιμασία για τη μελέτη

3 ημέρες πριν από τη δοκιμή, πρέπει να σταματήσετε να πίνετε αλκοόλ. Ορισμένα φάρμακα, όπως τα αντιβιοτικά, διακόπτονται σύμφωνα με τις οδηγίες του γιατρού.

Κανόνες προετοιμασίας κατά τη διάγνωση σεξουαλικά μεταδιδόμενων λοιμώξεων:

2 ημέρες πριν από τη δοκιμή, σταματήστε τη σεξουαλική επαφή.
2 ώρες πριν την εξέταση μην ουρήσετε.
Μην κάνετε λούσιμο το βράδυ πριν και το πρωί. πλένετε μόνο με ζεστό νερό χωρίς απορρυπαντικά.
μην κάνετε εξετάσεις PCR κατά τη διάρκεια και για 4 ημέρες μετά (στις γυναίκες).

Γενικοί κανόνες προετοιμασίας:

2 ημέρες νωρίτερα, αποκλείστε την έντονη σωματική δραστηριότητα και τον αθλητισμό.
το πρωί την ημέρα της μελέτης, μην καπνίζετε ή τρώτε φαγητό.
Εάν το υλικό λαμβάνεται από το στόμα και το ρινοφάρυγγα, μην βουρτσίζετε τα δόντια σας το πρωί.

Η αξιοπιστία αυτής της ακριβούς, αλλά δαπανηρής διαγνωστικής μεθόδου εξαρτάται από την εφαρμογή αυτών των απλών κανόνων. Η ανεξάρτητη ερμηνεία του αποτελέσματος δεν θα παρέχει τις απαραίτητες πληροφορίες σχετικά με την ασθένεια και τη θεραπεία της. Γι' αυτό, αφού λάβετε τα δεδομένα της εξέτασης PCR, πρέπει να συμβουλευτείτε γιατρό.

Με ποιον γιατρό πρέπει να απευθυνθώ;

Εάν υπάρχει υποψία για σεξουαλικά μεταδιδόμενο νόσημα, ένας γυναικολόγος, ουρολόγος, ανδρολόγος ή αφροδισιολόγος θα σας παραπέμψει για PCR. Μια μελέτη για ηπατίτιδα και λοίμωξη HIV συνταγογραφείται από ειδικό λοιμωξιολόγο και για φυματίωση - φθισίατρο. Η PCR χρησιμοποιείται στην πρακτική τους από γιατρούς πολλών ειδικοτήτων, για παράδειγμα, ογκολόγους, αιματολόγους, γαστρεντερολόγους και γενετιστές.

Στη σύγχρονη ιατρική, δίνεται μεγαλύτερη σημασία σε τεχνικές εργαστηριακής έρευνας υψηλής ακρίβειας που βασίζονται στην Αλυσιδωτή Αντίδραση Πολυμεράσης. Χάρη στη χρήση τεχνολογιών PCR, κατέστη δυνατή η διεξαγωγή ανάλυσης σε μοριακό γενετικό επίπεδο και ο εντοπισμός οξέων και χρόνιων μορφών κληρονομικών και μολυσματικών ασθενειών σε έναν ασθενή πολύ πριν από την εμφάνιση κλινικών συμπτωμάτων.

Τι είναι η διάγνωση PCR

Αυτή η μέθοδος αναπτύχθηκε από την Αμερικανίδα βιοχημική και βραβευμένη με Νόμπελ Carrie Mullis το 1984.

Πολλοί ειδικευμένοι ειδικοί αντιμετωπίζουν καθημερινά τεστ PCR και δεν μπορούν να φανταστούν την ακριβή διάγνωση των περισσότερων ενεργών μορφών παθολογιών χωρίς τα αποτελέσματά τους σε περιπτώσεις όπου οι ανοσολογικές και μικροβιολογικές μέθοδοι δεν λειτουργούν. Συμβαίνει συχνά διαφορετικοί ιοί να προκαλούν τα ίδια κλινικά συμπτώματα, Η ανάλυση PCR θα σας επιτρέψει να αναγνωρίσετε το παθογόνο στη χαμηλότερη συγκέντρωση στο βιοϋλικό και να αναγνωρίσετε ακόμη και μεμονωμένα κύτταρα ιών ή βακίλλων.

Σχετικά με τα διαγνωστικά PCR σε βίντεο

Η βάση της διάγνωσης PCR είναι η υπό ειδικές εργαστηριακές συνθήκες, επαναλαμβανόμενη ενίσχυση (πολλαπλασιασμός) ορισμένων τμημάτων DNA (δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ) - ανθρώπινο γενετικό υλικό.

Η όλη τεχνολογική διαδικασία αντιγραφής αποτελείται από διάφορα στάδια:

Μετουσίωσης – προετοιμασία του δείγματος, αυξάνοντας τη θερμοκρασία του βιοϋλικού (έως 95 °C), το 2-κλωνο DNA χωρίζεται σε δύο ξεχωριστούς κλώνους.
Ανόπτηση — το υπό μελέτη βιοϋλικό ψύχεται και σε αυτό προστίθενται αζωτούχα primers (αντιδραστήρια), τα οποία έχουν την ικανότητα να αναγνωρίζουν ειδικά αλληλουχίες στο μόριο DNA που είναι χαρακτηριστικές μόνο του παθογόνου παράγοντα και να συνδυάζονται με αυτές.
Επιμήκυνση – η ίδια η αντίδραση πολυμεράσης, λαμβάνει χώρα η ολοκλήρωση μιας μοναδικής μοριακής γενετικής θέσης, σε κάθε μία από τις συνδέσεις με τον εκκινητή σχηματίζεται ένας νέος κλώνος DNA, που συμπληρώνει δομικά τον θυγατρικό.

Ολόκληρος ο κύκλος επαναλαμβάνεται 20-30 φορές. Τελικά, σχηματίζεται ο αριθμός των συμπληρωματικών κλώνων DNA που είναι επαρκής για οπτική ανάλυση και σύγκριση των αποτελεσμάτων με διαθέσιμα δεδομένα για την κυτταρική δομή διαφόρων παθογόνων. Προσδιορίζεται ο ιός, η φύση της εμφάνισής του, η ισχύς της επίδρασής του στον οργανισμό και ο αριθμός των βακίλων που υπάρχουν. Αυτές οι πληροφορίες έχουν μεγάλη αξία για τον θεράποντα ιατρό όταν συνταγογραφεί αποτελεσματικές μεθόδους θεραπείας και επιλέγει φάρμακα.

Οι διαγνωστικές μέθοδοι PCR διαφέρουν από άλλες εργαστηριακές μεθόδους στα ακόλουθα:

άμεσος προσδιορισμός της παρουσίας παθογόνων.
υψηλή ευαισθησία, ειδικότητα και ευελιξία της διαδικασίας ανίχνευσης ιών.
Ταχύτητα ανάλυσης·
την ικανότητα διάγνωσης ασυμπτωματικών παθολογιών.

Τα αποτελέσματα της μελέτης μπορούν να φωτογραφηθούν ή να εισαχθούν σε μέσα ενημέρωσης ώστε να μπορούν να αξιολογηθούν από ανεξάρτητους εμπειρογνώμονες.

Πώς να προετοιμαστείτε σωστά για τη λήψη ενός τεστ PCR;

Διάφορα βιοϋλικά χρησιμοποιούνται για έρευνα:

αίμα;
Χλαπάτσα;
σάλιο;
ούρο;
πτύελο;
επιθηλιακές ξύσεις?
χυμός προστάτη?
Ξύσεις των βλεννογόνων.
αμνιακό υγρό;
ιστός πλακούντα?
εγκεφαλονωτιαίο, αρθρικό ή υπεζωκοτικό υγρό.
εκκρίσεις των γεννητικών οργάνων.

Ο σύγχρονος εργαστηριακός εξοπλισμός και ο επαγγελματισμός του εργαστηριακού ιατρού εγγυώνται στον ασθενή που υποβάλλεται σε ανάλυση PCR για να έχει ένα αξιόπιστο αποτέλεσμα. Αλλά η ακρίβεια της μελέτης εξαρτάται από την κατάλληλη προετοιμασία για τη δοκιμή και από τη συμμόρφωση με όλες τις συστάσεις για την επιλογή του βιοϋλικού.

Δεν είναι δύσκολο να προετοιμαστείτε σωστά για την ανάλυση, είναι σημαντικό να ακολουθήσετε όλους τους υπάρχοντες κανόνες:

Μία ημέρα πριν από την εξέταση, μην έχετε σεξουαλική επαφή.
Ακύρωση μαθημάτων γυμναστικής.
Μην επισκέπτεστε λουτρό ή σάουνα πριν την εξέταση.
Θα πρέπει να δειπνήσετε την προηγούμενη μέρα το αργότερο στις 20:00, να μην επιδοθείτε σε πικάντικα και λιπαρά φαγητά και να μην πίνετε αλκοόλ.
Το φλεβικό αίμα πρέπει να χορηγείται το πρωί πριν από τη διαδικασία, μην τρώτε, πίνετε ή καπνίζετε.

Πώς οι γυναίκες και οι άνδρες υποβάλλονται σε εξετάσεις PCR - χαρακτηριστικά της διαδικασίας

Η κύρια γενική απαίτηση για την επιλογή του βιοϋλικού είναι η επίτευξη της μέγιστης συγκέντρωσης μικροοργανισμών στο δείγμα και η απουσία ανεπιθύμητων ακαθαρσιών - βλέννας, αίμα ή πύον.

Κατά τη διάρκεια εξετάσεων για λοιμώξεις που μεταδίδονται μέσω της σεξουαλικής επαφής (ουρεαπλάσμωση, γαρδνερέλλωση, χλαμύδια, μυκοπλάσμωση, τριχομονίαση), συλλέγονται εκκρίσεις από τα γεννητικά όργανα:

στους άνδρες, ένα επίχρισμα ή απόξεση λαμβάνεται από το ουροποιητικό κανάλι (ουρήθρα).
στις γυναίκες - ένα επίχρισμα ή απόξεση από τον κόλπο, τον αυχενικό σωλήνα.

Κατά τη λήψη υλικού από την ουρογεννητική οδό, είναι σημαντικό να αποφεύγεται η μόλυνση. Για το σκοπό αυτό, οι ξύσεις λαμβάνονται από άνδρες όχι νωρίτερα από 2 ώρες μετά την τελευταία ούρηση, από γυναίκες - λαμβάνοντας υπόψη τις ημέρες του εμμηνορροϊκού κύκλου. Η περίσσεια βλέννας ή πύου αφαιρείται με αποστειρωμένα βαμβακερά μάκτρα, το βιοϋλικό συλλέγεται χρησιμοποιώντας ειδικούς πλαστικούς ανιχνευτές - αυτό μειώνει την πιθανότητα να εισέλθει αίμα στο δείγμα.

Η διαδικασία για τη λήψη ουρογεννητικής απόξεσης είναι αρκετά επώδυνη για τους άνδρες , γι' αυτό και η πρώτη μερίδα ούρων μετά από μια ολονύκτια κατακράτηση, η οποία περιέχει τη μεγαλύτερη ποσότητα επιθηλίου, χρησιμοποιείται συχνά για ανάλυση. Τα ούρα συλλέγονται σε αποστειρωμένο δοχείο με στεγανό καπάκι και παραδίδονται στο εργαστήριο το αργότερο δύο ώρες μετά τη συλλογή. Στο εργαστήριο, λαμβάνεται ένα κυτταρικό ίζημα ούρων για επακόλουθη εργασία με φυγοκέντρηση.

Ποιες λοιμώξεις περιλαμβάνονται στο σύμπλεγμα PCR-12;

Τα διαγνωστικά PCR χρησιμοποιούνται ενεργά από έμπειρους ειδικούς. Η μεγαλύτερη ζήτηση είναι η διάγνωση ιών και λοιμώξεων.

Ποιες 12 λοιμώξεις μπορούν να ανιχνευθούν χρησιμοποιώντας διαγνωστικά PCR;	Τι αποκαλύπτεται
HIV λοίμωξη	Ιός ανθρώπινης ανοσοανεπάρκειας τύπου 1/2
Ηπατίτιδα Α, Β, Γ, Γ	Ιοί ηπατίτιδας HAV, HBV, HCV, HGV
Μονοπυρήνωση	Ιός Epstein-Barr
Λοίμωξη από κυτταρομεγαλοϊό	Ο αιτιολογικός παράγοντας είναι ο κυτταρομεγαλοϊός
Ερπητική λοίμωξη	Ιός απλού έρπητα τύπου 1/2
Τα ΣΜΝ είναι λοιμώξεις που μεταδίδονται σεξουαλικά	Παθογόνα μικρόβια - ουρεόπλασμα, gardnellera, χλαμύδια, μυκόπλασμα, τριχομονάδες
Φυματίωση	Mycobacterium tuberculosis
Ογκογόνοι ιοί	Ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων - Ο ιός των ανθρωπίνων θηλωμάτων και τα ογκογόνα είδη του (14 τύποι)
Βορελίωση	Ο αιτιολογικός παράγοντας της εγκεφαλίτιδας που μεταδίδεται από κρότωνες
Λιστερίωση	Ο αιτιολογικός παράγοντας είναι η Listeria monocytogenes
Καντιντίαση	Μύκητες της οικογένειας Candida
Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού	Ο αιτιολογικός παράγοντας είναι το ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού

Επί του παρόντος, οι τεχνικές αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης διευρύνουν τις δυνατότητες διεξαγωγής έρευνας - η εισαγωγή γονότυπου και ματίσματος θραυσμάτων DNA ιστών έχει γίνει ευρέως διαδεδομένη σε διάφορους τομείς της σύγχρονης ιατρικής:

γυναικολογία;
ουρολογία;
Πνευμονολογία?
Γαστρεντερολογία;
αιματολογία;
ογκολογία.

Πού μπορώ να κάνω εξετάσεις φθηνά στην Ομοσπονδιακή Περιφέρεια των Ουραλίων;

Οι σύγχρονες διαγνωστικές μέθοδοι PCR εξελίσσονται συνεχώς. Η ίδια η τεχνική βελτιώνεται, νέες ποικιλίες PCR και νέα συστήματα δοκιμών που χρησιμοποιούνται για αλυσιδωτές αντιδράσεις εμφανίζονται. Αυτές οι καινοτομίες καθιστούν το κόστος αυτών των εξετάσεων πιο προσιτό για τους ασθενείς.