Μέθοδοι ανάλυσης PCR. Τι σημαίνει να σας συνταγογραφήσετε μια εξέταση PCR; PCR διαγνωστικά αποτελέσματα

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR, PCR - αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης) είναι μια μέθοδος λήψης πολλαπλών αντιγράφων ορισμένων θραυσμάτων DNA (γονιδίων) σε ένα βιολογικό δείγμα.

Η ουσία της PCR ως μεθόδου μοριακής βιολογίας είναι η επαναλαμβανόμενη επιλεκτική αντιγραφή ενός συγκεκριμένου γονιδίου (ενός τμήματος DNA) χρησιμοποιώντας ειδικά ένζυμα υπό συνθήκες in vitro. Ένα σημαντικό χαρακτηριστικό της PCR είναι η παραγωγή αντιγράφων ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA (γονιδίου) που πληροί συγκεκριμένες συνθήκες. Ένα συνώνυμο της διαδικασίας αντιγραφής του DNA είναι η «ενίσχυση». Αντιγραφή DNA in vivoμπορεί επίσης να θεωρηθεί ενίσχυση. Ωστόσο, σε αντίθεση με την αντιγραφή, η διαδικασία αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ενισχύει μικρά τμήματα DNA (μέγιστο 40.000 ζεύγη βάσεων).

Βασικές αρχές

Έτσι, η PCR είναι η επαναλαμβανόμενη αντιγραφή ορισμένων θραυσμάτων DNA in vitro κατά τη διάρκεια επαναλαμβανόμενων κύκλων θερμοκρασίας. Πώς γίνεται η διαδικασία αντίδρασης μέσα σε έναν κύκλο θερμοκρασίας;

Ο σχηματισμός της νουκλεοτιδικής αλυσίδας πραγματοποιείται από το ένζυμο πολυμεράση DNA. Ωστόσο, για να αρχίσει να λειτουργεί, το ένζυμο χρειάζεται μια επιφάνεια εκτόξευσης. Οι πλατφόρμες είναι "primers" (seeders) - συνθετικά ολιγονουκλεοτίδια μήκους 15-20 νουκλεοτιδίων. Πρέπει να υπάρχουν δύο εκκινητές (προς τα εμπρός και προς τα πίσω), είναι συμπληρωματικοί σε τμήματα του προτύπου DNA και είναι το τμήμα DNA που περιορίζεται από τους εκκινητές που θα αντιγραφεί πολλές φορές από την πολυμεράση DNA. Το έργο της πολυμεράσης είναι να προσθέτει διαδοχικά νουκλεοτίδια συμπληρωματικά στην αλληλουχία μήτρας DNA. Έτσι, σε έναν κύκλο θερμοκρασίας, δύο νέα θραύσματα DNA συντίθενται ξανά (καθώς το μόριο DNA είναι δίκλωνο, υπάρχουν αρχικά δύο μήτρες). Έτσι, σε 25-35 κύκλους, δισεκατομμύρια αντίγραφα της περιοχής DNA που προσδιορίζεται από τους εκκινητές συσσωρεύονται στον δοκιμαστικό σωλήνα. Η δομή ενός ξεχωριστού κύκλου μπορεί να αναπαρασταθεί ως εξής:

1. Μετουσίωσης DNA (τήξη, απόκλιση αλυσίδων DNA) - 95°C - 1 ή 2 λεπτά.
2. ανόπτηση εκκινητών (οι εκκινητές συνδέονται με το εκμαγείο DNA, η θερμοκρασία αυτού του σταδίου προσδιορίζεται από τη νουκλεοτιδική σύνθεση του εκκινητή) - 60°C (για παράδειγμα) - 1 λεπτό.
3. Επιμήκυνση DNA (η πολυμεράση συνθέτει μια αλυσίδα DNA) - 72°C - 1 λεπτό (ο χρόνος εξαρτάται από το μήκος του θραύσματος που συντίθεται).

Τα όργανα για τη χρήση της μεθόδου αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης στο εργαστήριο θα πρέπει να αποτελούνται από:

1. (ή, όπως ονομάζεται επίσης, θερμικός κυκλοποιητής).
2. συστήματα για s (για οπτικοποίηση των αποτελεσμάτων PCR).
3. συστήματα (για την ανάλυση των αποτελεσμάτων PCR).
4. (για προετοιμασία δείγματος).
5. σετ (μηχανικό ή ηλεκτρονικό).

Εκτός από τον κύριο και τον βοηθητικό εξοπλισμό για την πλήρη λειτουργία του εργαστηρίου PCR, απαιτούνται ορισμένα αναλώσιμα: αποστειρωμένα άκρα, δοκιμαστικοί σωλήνες, σχάρες για δοκιμαστικούς σωλήνες και διανομείς.

Η βάση αντιδραστηρίου σε ένα συμβατικό εργαστήριο PCR για τη διεξαγωγή μιας πλήρους αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης περιλαμβάνει το ένζυμο DNA πολυμεράση με ένα ρυθμιστικό διάλυμα, εκκινητές (μικρά συνθετικά θραύσματα DNA συμπληρωματικά στην αρχή και το τέλος του αναλυόμενου τμήματος του προτύπου DNA), μίγμα νουκλεοτιδίων (Α, Τ, G, C). Το καθαρισμένο νερό είναι επίσης απολύτως απαραίτητο.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου PCR

Υψηλή ευαισθησία της μελέτης

Η ευαισθησία της μεθόδου είναι τέτοια που είναι δυνατός ο πολλαπλασιασμός με PCR και η αναγνώριση της αλληλουχίας στόχου ακόμη και αν συμβεί μία φορά σε δείγμα 105 κυττάρων.

Ειδικότητα προσδιορισμού

Η PCR σάς επιτρέπει να ανιχνεύσετε το DNA ενός συγκεκριμένου μολυσματικού παράγοντα παρουσία του DNA άλλων μικροοργανισμών και του DNA του οργανισμού ξενιστή, καθώς και να πραγματοποιήσετε γονότυπο. Επιλέγοντας συγκεκριμένα συστατικά της αντίδρασης (primers), μπορείτε ταυτόχρονα να ανιχνεύσετε το DNA των στενά συγγενών μικροοργανισμών.

Η ευελιξία της μεθόδου PCR

Το γεγονός είναι ότι για τη διάγνωση PCR μολυσματικών ασθενειών ή κληρονομικών ανθρώπινων ασθενειών, μπορείτε να χρησιμοποιήσετε τον ίδιο εξοπλισμό, να ακολουθήσετε καθολικές διαδικασίες για την προετοιμασία και ανάλυση δειγμάτων, καθώς και τον ίδιο τύπο κιτ αντιδραστηρίων.

Εξοικονόμηση χρόνου

Ένα σημαντικό πλεονέκτημα της PCR είναι η απουσία σταδίων πολιτιστικής μικροβιολογικής εργασίας. Η προετοιμασία του δείγματος, η απόδοση της αντίδρασης και η ανάλυση των αποτελεσμάτων είναι απλοποιημένες και σε μεγάλο βαθμό αυτοματοποιημένες. Χάρη σε αυτό, ο χρόνος για την απόκτηση αποτελεσμάτων μπορεί να μειωθεί σε 4-5 ώρες.

Αποτελεσματικότητα της μεθόδου PCR

Εύρος κλινικού υλικού που μελετήθηκε

Όχι μόνο βιολογικό υλικό από έναν ασθενή μπορεί να χρησιμοποιηθεί ως δείγμα σε μια αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης, αλλά και πολλά άλλα υποστρώματα στα οποία τα μόρια DNA μπορούν να αναγνωριστούν με υψηλή ευαισθησία, για παράδειγμα, νερό, έδαφος, τρόφιμα, μικροοργανισμοί, επιχρίσματα και πολλά άλλα .

Όλα τα παραπάνω πλεονεκτήματα αυτής της μοναδικής μεθόδου - υψηλή ευαισθησία και ειδικότητα, ταυτοποίηση μολυσματικού παράγοντα και γονότυπος οποιουδήποτε ανθρώπινου γονιδίου, υψηλή απόδοση και εξοικονόμηση χρόνου, ευελιξία της βάσης οργάνων - επιτρέπουν στη μέθοδο PCR να χρησιμοποιείται ευρέως σήμερα στην κλινική διαγνωστικά, ιατρική πρακτική, επιστημονική έρευνα, ποιότητα ελέγχου και πολλούς άλλους τομείς.

Εφαρμογή PCR

Οι τομείς εφαρμογής της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ως σύγχρονης μεθόδου μοριακής βιολογίας είναι ποικίλοι. Αυτό οφείλεται σε μεγάλο βαθμό στο εύρος του υλικού που μπορεί να αναλυθεί (σχεδόν οτιδήποτε από το οποίο μπορεί να απομονωθεί περισσότερο ή λιγότερο υψηλής ποιότητας DNA μπορεί να γίνει αντικείμενο έρευνας), καθώς και στα επιλεγμένα primers. Οι κύριοι τομείς εφαρμογής της PCR:

κλινικό φάρμακο

• διάγνωση μολυσματικών ασθενειών
• διάγνωση κληρονομικών ασθενειών
• ανίχνευση μεταλλάξεων
• γονότυπος
• τεχνολογίες κυττάρων
• δημιουργία γενετικών διαβατηρίων

οικολογία

• περιβαλλοντική παρακολούθηση
• ανάλυση τροφίμων
• ανάλυση γενετικά τροποποιημένων οργανισμών (ΓΤΟ)

ιατροδικαστική και εγκληματολογία

• προσωπική αναγνώριση
• καθιέρωση της πατρότητας

φαρμακολογία

κτηνιατρική

επιστημονική έρευνα (μοριακή βιολογία, γενετική)

Οργάνωση εργαστηρίου PCR

Πληροφορίες Παραγγελίας

Ονομα	Ενταση ΗΧΟΥ	Παραγωγή	Μέθοδος	Cat.No.

Η μέθοδος της αλυσιδωτής αντίδρασης πολυμεράσης ή PCR χρησιμοποιείται στην εργαστηριακή διάγνωση των περισσότερων μολυσματικών ασθενειών. Σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε το γενετικό υλικό των μικροοργανισμών στο υπό μελέτη υλικό και έτσι να τους αναγνωρίσετε.

Τι είναι

Η μέθοδος αναπτύχθηκε το 1983 και το 1993 ο συγγραφέας της, Mullis, έλαβε το βραβείο Νόμπελ.

Βασικά στοιχεία της μεθόδου

Η ανάλυση PCR ανιχνεύει μοναδικό γενετικό υλικό στο υπό μελέτη υλικό, γεγονός που καθιστά δυνατή την ταυτοποίηση του μικροοργανισμού.

Κάθε είδος μικροοργανισμού, φυτού ή ζώου έχει ένα μοναδικό σύνολο χρωμοσωμάτων. Σχηματίζονται από το DNA - δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ. Τα μικρά θραύσματα του DNA ονομάζονται νουκλεοτίδια και η συγκεκριμένη αλληλουχία τους αποτελεί ένα γονίδιο. Κάθε γονίδιο κωδικοποιεί τη σύνθεση μιας πρωτεΐνης, για παράδειγμα, κολλαγόνου, λευκωματίνης και όλων των άλλων. Η νουκλεοτιδική αλληλουχία είναι μοναδική. Για κάθε είδος ζώντων οργανισμών, υπάρχουν κοινά τμήματα DNA που είναι υπεύθυνα για την ομοιομορφία εντός αυτού του είδους.

Η ανάλυση DNA πολλών εκατοντάδων μικροβίων που περιλαμβάνονται στο ερευνητικό υλικό δεν θα αποκαλύψει πρότυπα ειδών. Είναι απαραίτητο να πολλαπλασιαστεί ο αριθμός των σημαντικών γενετικών συστατικών, γεγονός που θα καταστήσει δυνατό τον εντοπισμό τους. Αυτό το πρόβλημα επιλύεται με τη μέθοδο PCR.

Η έρευνα αφορά το πεδίο της μοριακής βιολογίας. Η DNA πολυμεράση και τα ελεύθερα νουκλεοτίδια προστίθενται στο μικροβιακό DNA. Η πολυμεράση είναι ένα ένζυμο που εξασφαλίζει πολλαπλά αντίγραφα της επιθυμητής περιοχής από διαθέσιμα νουκλεοτίδια. Η διαδικασία ξεκινά με εκκινητές - βραχείς κλώνους ριβονουκλεϊκού οξέος (RNA) που συνδέονται στην αρχή του επιθυμητού γονιδίου.

Η διαδικασία ανάλυσης αποτελείται από πολλές φάσεις, καθεμία από τις οποίες απαιτεί συγκεκριμένο χρόνο και θερμοκρασία. Μέσα σε λίγες ώρες, η απαιτούμενη ποσότητα υλικού για ανάλυση λαμβάνεται από ένα χιλιοστό του γραμμαρίου βακτηριακού DNA. Ο σύγχρονος εξοπλισμός καθιστά δυνατή την επανειλημμένη αντιγραφή του DNA ακόμη και ενός κυττάρου, για παράδειγμα, ενός σπέρματος.

Πρόοδος της μελέτης

Βήματα ανάλυσης:

• λήψη βιολογικού υλικού (αίμα, ούρα, κολπικές εκκρίσεις, σάλιο κ.λπ.) από τον ασθενή και παράδοση στο εργαστήριο.
• διαχωρισμός δύο κλώνων DNA, η συνένωση των οποίων σχηματίζει ένα χρωμόσωμα και καθαρισμός τους από ξένες ακαθαρσίες.
• διπλασιάζοντας το επιθυμητό τμήμα του κλώνου DNA, με αποτέλεσμα η ποσότητα του να αυξάνεται εκθετικά.
• Επεξεργασία του προκύπτοντος υλικού με διαλύματα που προκαλούν ειδική φωταύγεια των θραυσμάτων DNA που προκύπτουν, αυτή η χρώση χρησιμοποιείται για την αναγνώριση του βακτηρίου ή του ιού στην πηγή. Η ηλεκτροφόρηση χρησιμοποιείται για τον διαχωρισμό κλασμάτων DNA.

Η διάρκεια της ανάλυσης είναι 4-5 ώρες.

Πλεονεκτήματα της μεθόδου PCR

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα έναντι των παραδοσιακών μεθόδων αναγνώρισης μολυσματικών παραγόντων:

• άμεσος προσδιορισμός των γονιδίων ενός μικροοργανισμού, σε αντίθεση με την ανίχνευση αντισωμάτων σε αυτόν σε πολλές άλλες μεθόδους ταυτοποίησης.
• ειδικότητα, δηλαδή προσδιορισμός ενός συγκεκριμένου τύπου παθογόνου.
• ευαισθησία: ακόμη και ένα κύτταρο ενός μικροοργανισμού είναι αρκετό για τη διάγνωση. γενικά, η απαιτούμενη ποσότητα παθογόνου είναι 10 φορές μικρότερη από ό,τι για άλλες μεθόδους.
• η ευελιξία του βιοϋλικού - δεν εξετάζεται μόνο το αίμα, αλλά και τα πυκνά κύτταρα ιστών, οι ξύσεις από το επιθήλιο, οι βλεννώδεις εκκρίσεις και οποιοδήποτε άλλο περιβάλλον όπου μπορεί να υπάρχει μικρόβιο.
• η ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων είναι αρκετές φορές υψηλότερη από ό,τι όταν χρησιμοποιείτε άλλες μεθόδους.
• την ικανότητα αναγνώρισης χρόνιων, υποτονικών και λανθάνοντων λοιμώξεων.
• απολύμανση υλικού που λαμβάνεται από ασθενή και πρόληψη μόλυνσης του προσωπικού του εργαστηρίου·
• πλήρης αυτοματοποίηση της ερευνητικής διαδικασίας.

Μειονεκτήματα της ανάλυσης

Τα μειονεκτήματα της PCR σχετίζονται κυρίως με την τεχνική πολυπλοκότητά της:

• είναι απαραίτητο να επιλέξετε τις σωστές αλληλουχίες RNA - εκκινητές και επίσης να προετοιμάσετε ένα μείγμα νουκλεοτιδίων για σύνθεση DNA.
• η μέθοδος είναι πολύ ευαίσθητη, επομένως εάν υπάρχουν διαφορετικοί τύποι μικροβίων στο δείγμα, μπορεί να δώσει εσφαλμένα αποτελέσματα.
• είναι απαραίτητο να καθαριστεί προσεκτικά το αναλυόμενο υλικό από ακαθαρσίες ανθρώπινων πρωτεϊνών και φαρμάκων, καθώς μειώνουν την ακρίβεια της διάγνωσης.
• Η σύγκριση ελέγχου των αποτελεσμάτων με δείγματα που είναι γνωστό ότι περιέχουν ή δεν περιέχουν μικροβιακό υλικό, καθώς και χωρίς καθόλου DNA, απαιτείται για τον προσδιορισμό σφαλμάτων και μόλυνσης.

Τα ψευδώς αρνητικά αποτελέσματα PCR προκαλούνται από παραβίαση της τεχνικής ανάλυσης και αλλαγές στη γενετική αλληλουχία οποιουδήποτε από τα συστατικά της αντίδρασης. Εσφαλμένα θετικά δεδομένα εμφανίζονται επίσης όταν τα νουκλεοτίδια των εκκινητών και άλλων αντιδραστηρίων που χρησιμοποιούνται συμπίπτουν κατά λάθος με ένα από τα γονίδια του μικροοργανισμού.

Η απομόνωση ενός μικροοργανισμού δεν δείχνει πάντα ότι ήταν η αιτία της νόσου. Υπάρχει ένα άλλο πρόβλημα κατά την ανάλυση του ανθρώπινου DNA: η γενετική βάση των περισσότερων ασθενειών είναι ακόμα άγνωστη, γεγονός που καθιστά αδύνατη τη διάγνωση μη μολυσματικών παθολογιών σε μικροβιολογικό επίπεδο. Αυτός ο τομέας της ιατρικής γενετικής αναπτύσσεται πολύ ενεργά.

Ενδείξεις για εξέταση PCR

Στις περισσότερες περιπτώσεις, τα διαγνωστικά PCR χρησιμοποιούνται σε άτομα με μολυσματικές ασθένειες για τον προσδιορισμό του μικροοργανισμού που προκάλεσε τη νόσο.

Αυτή η ανάλυση χρησιμοποιείται στις ακόλουθες περιπτώσεις:

• την ανάγκη ανίχνευσης και αναγνώρισης ιών, βακτηρίων, πρωτόζωων σε οποιεσδήποτε μολυσματικές ασθένειες όταν απαιτείται διαγνωστική ακρίβεια·
• ταυτοποίηση ενός ατόμου σε σύγκριση με γενετικό υλικό γνωστής προέλευσης·
• ανάλυση ιστών που λαμβάνονται με τεχνική λεπτής βελόνας, οι οποίοι είναι πολύ δύσκολο να εξεταστούν με άλλες μεθόδους.
• διάγνωση λευχαιμίας και κακοήθων όγκων.
• διεξαγωγή πειραμάτων με εμφύτευση εμβρυϊκών βλαστοκυττάρων σε ζώα (απαγορεύεται η χρήση τέτοιων κυττάρων σε ανθρώπους), καθώς και σειρές αναπαραγωγής εργαστηριακών ποντικών με προκαθορισμένη γενετική ασθένεια.

Οι προοπτικές για τη χρήση της αντίδρασης PCR και οι παραλλαγές της στην ιατρική και τη βιολογία αιχμαλωτίζουν τη φαντασία - από τη δοκιμή νέων φαρμάκων σε επίπεδο γονιδίου έως τη δημιουργία διαγονιδιακών οργανισμών με συγκεκριμένες ιδιότητες. Εργασίες προς αυτή την κατεύθυνση γίνονται στα μεγαλύτερα εργαστήρια στον κόσμο, γεγονός που βοηθά στη βελτίωση της μεθόδου PCR σε εφαρμοσμένο επίπεδο για τη διάγνωση των ανθρώπινων λοιμωδών νοσημάτων.

Στην ιατρική, η μέθοδος PCR χρησιμοποιείται συνήθως για τη διάγνωση και την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας για τις ακόλουθες ασθένειες:

• ενδοκυτταρικές λοιμώξεις, για παράδειγμα, ή?
• ασθένειες που μεταδίδονται μέσω της σεξουαλικής επαφής·
• Λοίμωξη από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού και πολλά άλλα.

Προετοιμασία για τη μελέτη

3 ημέρες πριν από τη δοκιμή, πρέπει να σταματήσετε να πίνετε αλκοόλ. Ορισμένα φάρμακα, όπως τα αντιβιοτικά, διακόπτονται σύμφωνα με τις οδηγίες του γιατρού.

Κανόνες προετοιμασίας κατά τη διάγνωση σεξουαλικά μεταδιδόμενων λοιμώξεων:

• 2 ημέρες πριν από τη δοκιμή, σταματήστε τη σεξουαλική επαφή.
• 2 ώρες πριν την εξέταση μην ουρήσετε.
• Μην κάνετε λούσιμο το βράδυ πριν και το πρωί. πλένετε μόνο με ζεστό νερό χωρίς απορρυπαντικά.
• μην κάνετε εξετάσεις PCR κατά τη διάρκεια και για 4 ημέρες μετά (στις γυναίκες).

Γενικοί κανόνες προετοιμασίας:

• 2 ημέρες νωρίτερα, αποκλείστε την έντονη σωματική δραστηριότητα και τον αθλητισμό.
• το πρωί την ημέρα της μελέτης, μην καπνίζετε ή τρώτε φαγητό.
• Εάν το υλικό λαμβάνεται από το στόμα και το ρινοφάρυγγα, μην βουρτσίζετε τα δόντια σας το πρωί.

Η αξιοπιστία αυτής της ακριβούς, αλλά δαπανηρής διαγνωστικής μεθόδου εξαρτάται από την εφαρμογή αυτών των απλών κανόνων. Η ανεξάρτητη ερμηνεία του αποτελέσματος δεν θα παρέχει τις απαραίτητες πληροφορίες σχετικά με την ασθένεια και τη θεραπεία της. Γι' αυτό, αφού λάβετε τα δεδομένα της εξέτασης PCR, πρέπει να συμβουλευτείτε γιατρό.

Με ποιον γιατρό πρέπει να απευθυνθώ;

Εάν υπάρχει υποψία για σεξουαλικά μεταδιδόμενο νόσημα, ένας γυναικολόγος, ουρολόγος, ανδρολόγος ή αφροδισιολόγος θα σας παραπέμψει για PCR. Μια μελέτη για ηπατίτιδα και λοίμωξη HIV συνταγογραφείται από ειδικό λοιμωξιολόγο και για φυματίωση - φθισίατρο. Η PCR χρησιμοποιείται στην πρακτική τους από γιατρούς πολλών ειδικοτήτων, για παράδειγμα, ογκολόγους, αιματολόγους, γαστρεντερολόγους και γενετιστές.

Γενετική των βακτηρίων. Πληροφορίες για το δεύτερο μάθημα.

Αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι μια μέθοδος που επιτρέπει πολλαπλή αύξηση (ενίσχυση) στην ποσότητα ορισμένων μορίων DNA στο αναλυόμενο δείγμα (συμπεριλαμβανομένου του βιολογικού υλικού ή της καθαρής καλλιέργειας).

Τα κύρια πλεονεκτήματα της PCR ως διαγνωστικής μεθόδου στη μικροβιολογία είναι η πολύ υψηλή ευαισθησία της, που επιτρέπει την ανίχνευση εξαιρετικά χαμηλών συγκεντρώσεων παθογόνων στα δείγματα, καθώς και ρυθμιζόμενη ειδικότητα, επιτρέποντας την ανίχνευση ή αναγνώριση παθογόνων σε επίπεδο γένους, είδους ή υποείδους. . Το κύριο μειονέκτημα της PCR προκύπτει από την εξαιρετικά υψηλή ευαισθησία της—είναι πολύ εύκολο τα δείγματα να μολυνθούν με DNA από θετικό μάρτυρα, άλλο δείγμα ή προϊόν PCR, με αποτέλεσμα μια ψευδώς θετική αντίδραση. Αυτό επιβάλλει σοβαρούς περιορισμούς στις συνθήκες υπό τις οποίες διεξάγεται η ανάμιξη και η εργασία με τα τελικά προϊόντα PCR.

Διεξαγωγή PCR.Παρασκευάζεται ένα μείγμα αντίδρασης που περιέχει τα ακόλουθα συστατικά:

Απομονωμένο DNA από το δείγμα δοκιμής,

Ρυθμιστικό διάλυμα,

Ιόντα Mg2+ (απαραίτητα για τη λειτουργία του ενζύμου),

Δύο εκκινητές είναι μονόκλωνα βραχέα μόρια DNA (τις περισσότερες φορές μήκους 18 έως 24 νουκλεοτιδίων), συμπληρωματικά προς τα άκρα των διαφορετικών κλώνων της αλληλουχίας DNA που ανιχνεύεται.

Μίγμα τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων.

Ανθεκτική στη θερμότητα πολυμεράση DNA (η πολυμεράση Taq χρησιμοποιείται συχνότερα - μια πολυμεράση που απομονώνεται από Thermus aquaticus).

Αυτό το μείγμα αντίδρασης τοποθετείται στη συνέχεια σε έναν θερμικό κυκλοποιητή, ο οποίος είναι ουσιαστικά ένας προγραμματιζόμενος θερμοστάτης. Ο θερμικός ανακυκλωτής πραγματοποιεί 30-40 κύκλους μεταβολών θερμοκρασίας. Κάθε ένας από αυτούς τους κύκλους αποτελείται από τρία στάδια (βλ. Εικ. 1):

Μετουσίωσης (θερμοκρασία 94 o C) - οι αλυσίδες υδρογόνου σπάνε και οι κλώνοι του DNA αποκλίνουν.

Ανόπτηση εκκινητών (η θερμοκρασία είναι συνήθως γύρω στους 50-60 o C) - οι εκκινητές συνδέονται στα άκρα των αλυσίδων DNA. Γενικά, όταν η θερμοκρασία μειώνεται, είναι ενεργειακά πιο ευνοϊκό να επανασυνδεθούν οι αρχικές αλυσίδες DNA από το δείγμα δοκιμής (reaturation), ωστόσο, η συγκέντρωση των εκκινητών στο μείγμα αντίδρασης είναι πολλές τάξεις μεγέθους μεγαλύτερη από τη συγκέντρωση του DNA από το δείγμα (τουλάχιστον στους αρχικούς κύκλους PCR), έτσι η αντίδραση ανόπτησης εκκινητών προχωρά ταχύτερα από το DNA επαναδιάταξης. Η θερμοκρασία ανόπτησης επιλέγεται ανάλογα με τις θερμοκρασίες τήξης (μετουσίωσης) των ασταριών.

Επιμήκυνση (η θερμοκρασία είναι συνήθως 72 o C) - Η πολυμεράση DNA συμπληρώνει τους εκκινητές κατά μήκος του εκμαγείου των μακριών αλυσίδων DNA. Η θερμοκρασία αντιστοιχεί στη βέλτιστη θερμοκρασία λειτουργίας της χρησιμοποιούμενης πολυμεράσης DNA.

Η ανίχνευση των αποτελεσμάτων διαφέρει σε διαφορετικές εκδόσεις της PCR και περιγράφεται στην ενότητα «Τύποι PCR».

Δυναμική PCR

Στους πρώιμους κύκλους PCR, ο αριθμός των μορίων δίκλωνου DNA, το μέγεθος των οποίων καθορίζεται από την απόσταση μεταξύ των θέσεων προσγείωσης του εκκινητή, διπλασιάζεται με κάθε κύκλο. Σχηματίζεται επίσης μια μικρή ποσότητα μακρύτερων μορίων DNA, τα οποία μπορούν να παραμεληθούν (βλ. Εικ. 2).

Έτσι, στους πρώιμους κύκλους, η ποσότητα του προϊόντος PCR περιγράφεται από τον τύπο m*2 n, όπου m είναι η αρχική ποσότητα του επιθυμητού DNA στο δείγμα, n είναι ο αριθμός των κύκλων. Στη συνέχεια η αντίδραση φτάνει σε ένα οροπέδιο. Αυτό συμβαίνει λόγω της συσσώρευσης του προϊόντος της αντίδρασης, μιας μείωσης στη συγκέντρωση των εκκινητών και των τριφωσφορικών δεοξυνουκλεοτιδίων, και επίσης λόγω της αύξησης της συγκέντρωσης πυροφωσφορικού (βλ. Εικόνα 3).

Τύποι PCR

Συμβατική PCR

Σε αυτήν την έκδοση της διάταξης PCR, η αντίδραση προχωρά για έναν προεπιλεγμένο αριθμό κύκλων (30-40), μετά από τους οποίους αναλύεται εάν η συσσώρευση μορίων δίκλωνου DNA έχει συμβεί στο μείγμα αντίδρασης.

Αυτή η επιλογή για την εκτέλεση PCR, όταν χρησιμοποιείται ως διαγνωστική μέθοδος, είναι μια ποιοτική μέθοδος. Μια θετική αντίδραση υποδηλώνει την παρουσία τουλάχιστον ιχνοποσοτήτων των επιθυμητών μορίων DNA στο δείγμα. Μια αρνητική αντίδραση υποδηλώνει την απουσία τους. Η ποσοτική εκτίμηση της περιεκτικότητας των αρχικών μορίων DNA στο δείγμα είναι αδύνατη λόγω του ότι η αντίδραση φτάνει σε ένα οροπέδιο.

Η κύρια μέθοδος για την ανίχνευση της παρουσίας ενός προϊόντος είναι η ηλεκτροφόρηση σε γέλη αγαρόζης ή πολυακρυλαμιδίου. Τα προϊόντα PCR διαχωρίζονται σε ένα πήκτωμα υπό την επίδραση ηλεκτρικού πεδίου ανάλογα με το μοριακό τους βάρος. Στο πήκτωμα προστίθεται μια παρεμβαλλόμενη χρωστική (φθορίζοντας σε κατάσταση δίκλωνου DNA - πιο συχνά βρωμιούχο αιθίδιο). Έτσι, κατά την ακτινοβολία με υπεριώδες φως, θα είναι δυνατό να φανεί η παρουσία ή η απουσία μιας λωρίδας που αντιστοιχεί σε DNA του απαιτούμενου μοριακού βάρους. Κατά τη διεξαγωγή PCR για διαγνωστικούς σκοπούς, χρησιμοποιούνται πάντα μάρτυρες θετικής και αρνητικής αντίδρασης, με τους οποίους συγκρίνονται τα δείγματα (βλ. Εικ. 4).

PCR σε πραγματικό χρόνο

Σε αυτή την έκδοση της PCR, η ποσότητα του προϊόντος PCR στο μείγμα της αντίδρασης καταγράφεται συνεχώς κατά τη διάρκεια της αντίδρασης. Αυτό σας επιτρέπει να κατασκευάσετε μια καμπύλη αντίδρασης (βλ. Εικ. 3) και, βάσει αυτής, να υπολογίσετε τον αριθμό των επιθυμητών μορίων DNA στα δείγματα.

Ένας τύπος PCR πραγματικού χρόνου είναι η χρήση μιας παρεμβαλλόμενης χρωστικής, η οποία προστίθεται απευθείας στο μείγμα αντίδρασης (το SYBRGreen χρησιμοποιείται συχνότερα). Ένας άλλος τύπος είναι η χρήση ενός από τους τύπους ανιχνευτών φθορισμού που συνδέονται σε μια θέση μέσα στο προϊόν PCR, γεγονός που καθιστά δυνατή την αύξηση της εξειδίκευσης της ανίχνευσης (βλ. Εικ. 5 Η ανίχνευση φθορισμού εμφανίζεται απευθείας στη συσκευή κατά τη διάρκεια της αντίδρασης).

Εκτός από τη δυνατότητα ποσοτικής ανίχνευσης, υπάρχουν και άλλα πλεονεκτήματα της PCR σε πραγματικό χρόνο σε σύγκριση με τη συμβατική PCR. Αυτή η επιλογή PCR είναι απλούστερη, ταχύτερη και επίσης δεν απαιτεί άνοιγμα σωλήνων με προϊόντα PCR, γεγονός που μειώνει την πιθανότητα μόλυνσης άλλων δειγμάτων. Το κύριο μειονέκτημα είναι το υψηλότερο κόστος ενός θερμικού κυκλωτή με ενσωματωμένες δυνατότητες ανίχνευσης φθορισμού σε σύγκριση με έναν συμβατικό.

Ψηφιακή ποσοτική PCR

Μια νέα, ακριβή και σπάνια χρησιμοποιούμενη έκδοση της PCR που σας επιτρέπει να προσδιορίσετε με μεγαλύτερη ακρίβεια την ποσότητα του DNA σε ένα δείγμα Σε αυτήν την έκδοση, το μείγμα αντίδρασης που περιέχει μια φθορίζουσα χρωστική ουσία χωρίζεται σε έναν τεράστιο αριθμό μικροσκοπικών όγκων (για παράδειγμα, σταγονίδια σε ένα γαλάκτωμα). Μετά την PCR, αναλύεται σε ποιο κλάσμα σταγονιδίων ήταν θετική η αντίδραση και, κατά συνέπεια, παρατηρείται φθορισμός. Αυτό το κλάσμα θα είναι ανάλογο με τον αριθμό των μορίων DNA που αναζητούνται στο δείγμα.

PCR αντίστροφης μεταγραφής

Σε αυτή την περίπτωση, πριν από τη μία ή την άλλη εκδοχή της PCR, πραγματοποιείται μια αντίδραση αντίστροφης μεταγραφής (RNA σε DNA) χρησιμοποιώντας το ένζυμο reversetase. Έτσι, αυτή η μέθοδος επιτρέπει την ποιοτική ή ποσοτική ανίχνευση μορίων RNA. Αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί για την ανίχνευση ιών RNA ή τον προσδιορισμό του επιπέδου μεταγραφής (ποσότητα mRNA) ενός συγκεκριμένου γονιδίου.

Εικόνα 1.Στάδια PCR. Τα αστάρια υποδεικνύονται με κόκκινο χρώμα.

Σχήμα 2.Η συσσώρευση μορίων δίκλωνου DNA περιορίζεται από εκκινητές κατά τη διάρκεια της PCR.

Εικόνα 3.Δυναμική της αντίδρασης PCR σε διαφορετικές αρχικές συγκεντρώσεις των επιθυμητών μορίων DNA στο δείγμα. (α) – υψηλότερη συγκέντρωση (β) – ενδιάμεση συγκέντρωση (γ) – χαμηλότερη συγκέντρωση

Εικόνα 4.Ηλεκτροφόρηση αγαρόζης προϊόντων PCR. K+ – θετικός μάρτυρας (το επιθυμητό DNA είναι γνωστό ότι υπάρχει). 1-7 – δείγματα δοκιμής (από τα οποία 1-2 είναι θετικά, 3-7 αρνητικά). Κ- – αρνητικός έλεγχος (το επιθυμητό DNA προφανώς απουσιάζει). Σε πολλές περιπτώσεις, εκτός από το προϊόν-στόχο, είναι ορατά ελαφρύτερα μη ειδικά προϊόντα αντίδρασης (διμερή εκκινητών).

Εικόνα 5.Μέθοδοι ανίχνευσης με χρήση PCR σε πραγματικό χρόνο. (α) – παρεμβαλλόμενη βαφή – φθορίζει όταν συνδέεται με δίκλωνο DNA (β) – ανιχνευτής Taqman – ο φθορισμός εμφανίζεται όταν ο ανιχνευτής διασπάται από πολυμεράση DNA με δραστηριότητα ενδονουκλεάσης 5’-3’ λόγω διαχωρισμού του φθοροφόρου και του σβηστήρα. (γ) – ανιχνευτής MolecularBeacon - ο φθορισμός εμφανίζεται όταν ο ανιχνευτής υβριδοποιείται με το θραύσμα στόχο λόγω του χωρικού διαχωρισμού του φθοροφόρου και του αποσβεστήρα (δ) – Ανιχνευτές LightCycler - Ο φθορισμός δέκτη εμφανίζεται όταν οι ανιχνευτές (που περιέχουν δέκτη και δότη) υβριδοποιούνται με το θραύσμα στόχου λόγω της μεταφοράς συντονισμού της ενέργειας φθορισμού (FRET).

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης είναι γνωστή εδώ και 30 χρόνια. Χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλούς τομείς, από την αρχαιολογία μέχρι τη γενετική.

Είναι η μέθοδος PCR που βοηθά στην καθιέρωση της πατρότητας, αλλά χρησιμοποιείται συχνότερα για τον εντοπισμό διαφόρων μολυσματικών ασθενειών στο ανθρώπινο σώμα.

Πώς γίνεται η ανάλυση PCR και τι είναι; Θα προσπαθήσουμε να απαντήσουμε σε αυτές τις ερωτήσεις λεπτομερώς.

Ανάλυση PCR - τι είναι;

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) είναι μια μοριακή γενετική διαγνωστική μέθοδος υψηλής ακρίβειας που σας επιτρέπει να εντοπίσετε διάφορες μολυσματικές και κληρονομικές ασθένειες στον άνθρωπο, τόσο στο οξύ όσο και στο χρόνιο στάδιο και πολύ πριν εκδηλωθεί η ασθένεια.

Η μέθοδος PCR είναι απολύτως συγκεκριμένη και, εάν εκτελεστεί σωστά, δεν μπορεί να δώσει ψευδώς θετικό αποτέλεσμα. Δηλαδή, αν δεν υπάρχει μόλυνση, τότε η ανάλυση δεν θα δείξει ποτέ ότι υπάρχει. Ως εκ τούτου, τώρα πολύ συχνά, για να επιβεβαιώσουν τη διάγνωση, κάνουν επιπλέον μια εξέταση PCR για να προσδιορίσουν το παθογόνο και τη φύση του.

Η αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) αναπτύχθηκε από τον Kary Mullis (ΗΠΑ) το 1983, για την οποία τιμήθηκε με το Νόμπελ Χημείας το 1993.

Ποιο είναι το πλεονέκτημα αυτής της μεθόδου;

Η διάγνωση με αυτήν τη μέθοδο σάς επιτρέπει να βρείτε το παθογόνο απευθείας στο γονίδιο, το οποίο περιέχεται στα υπό μελέτη υλικά. Αυτή είναι η πιο ακριβής εξέταση για σεξουαλικά μεταδιδόμενες λοιμώξεις, κρυφές λοιμώξεις και διάφορα σεξουαλικά μεταδιδόμενα νοσήματα.

Διαφορές μεταξύ διαγνωστικών PCR και άλλων μεθόδων εργαστηριακής έρευναςέχουν ως εξής:

• η μέθοδος στοχεύει στον εντοπισμό του ίδιου του παθογόνου.
• Τα διαγνωστικά με τη χρήση της μεθόδου PCR διακρίνονται από την ευελιξία τους: για την ανίχνευση πολλών παθογόνων.
• ασθένειες, μόνο ένα βιολογικό δείγμα του ασθενούς είναι αρκετό.
• η μέθοδος είναι ιδιαίτερα ευαίσθητη και δεν συνοδεύεται από άλλες διασταυρούμενες αντιδράσεις.

Επιπλέον, το πλεονέκτημα της διάγνωσης PCR είναι ότι οποιοδήποτε βιολογικό υλικό του ασθενούς είναι κατάλληλο για ανάλυση: αίμα, εκκρίσεις γεννητικών οργάνων, ούρα, σπέρμα.

Ποιες λοιμώξεις μπορεί να ανιχνεύσει ένα επίχρισμα PCR;

Ένας μεγάλος αριθμός μολυσματικών παραγόντων μπορεί να υπάρχει στο σώμα, συμπεριλαμβανομένων των «κρυφών» που δεν εκδηλώνονται για μεγάλο χρονικό διάστημα.

Ανάλυση επιχρίσματος PCR σας επιτρέπει να ανιχνεύσετε τέτοιες λοιμώξεις:

• ουρεπλάσμωση των γεννητικών οργάνων.
• καντιντίαση();
• έρπης;
• παρουσία καρκινικών κυττάρων?
• αξιολόγηση της ορμονικής κατάστασης.

Το υλικό δοκιμής για PCR είναι συνήθως πτύελα, σάλιο, ούρα και αίμα. Πριν από τη διεξαγωγή της ανάλυσης, πρέπει να προετοιμαστείτε προσεκτικά για αυτήν συμβουλευόμενοι πρώτα το γιατρό σας.

Το αίμα για την PCR δίνεται συνήθως με άδειο στομάχι. Καλά αποτελέσματα φαίνονται με ανάλυση όταν το υλικό για έρευνα λαμβάνεται από τον αυχενικό σωλήνα ή την ουρήθρα. Σε αυτή την περίπτωση, είναι καλύτερο να πραγματοποιήσετε διάγνωση PCR το αργότερο μία ημέρα μετά τη σεξουαλική επαφή.

Τύποι PCR

Η PCR χρησιμοποιείται σε πολλούς τομείς για δοκιμές και επιστημονικά πειράματα. Υπάρχουν διάφορες μέθοδοι ανάλυσης:

1. PCR αντίστροφης μεταγραφής(Reverse Transcription PCR, RT-PCR) - χρησιμοποιείται για την ενίσχυση, απομόνωση ή ταυτοποίηση μιας γνωστής αλληλουχίας από μια βιβλιοθήκη RNA.
2. Αντεστραμμένη PCR(Αντίστροφη PCR (Αγγλικά)) - χρησιμοποιείται εάν είναι γνωστή μόνο μια μικρή περιοχή εντός της επιθυμητής αλληλουχίας. Αυτή η μέθοδος είναι ιδιαίτερα χρήσιμη όταν πρόκειται για τον προσδιορισμό γειτονικών αλληλουχιών μετά την εισαγωγή του DNA στο γονιδίωμα.
3. Η Nested PCR χρησιμοποιείται για τη μείωση του αριθμού των υποπροϊόντων της αντίδρασης. Χρησιμοποιούνται δύο ζεύγη εκκινητών και διεξάγονται δύο διαδοχικές αντιδράσεις.
4. Ασύμμετρη PCR(Αγγλικά: Asymmetric PCR) - πραγματοποιείται όταν είναι απαραίτητο να ενισχυθεί κυρίως ένας από τους κλώνους του αρχικού DNA. Χρησιμοποιείται σε ορισμένες τεχνικές ανάλυσης αλληλουχίας και υβριδοποίησης.
5. Ποσοτική PCR(Quantitative PCR, Q-PCR (Αγγλικά)) ή PCR σε πραγματικό χρόνο - χρησιμοποιείται για την άμεση παρακολούθηση της μέτρησης της ποσότητας ενός συγκεκριμένου προϊόντος PCR σε κάθε κύκλο αντίδρασης.
6. Βήμα προς βήμα PCR (Touchdown PCR) - χρησιμοποιώντας αυτήν την προσέγγιση, η επίδραση της μη ειδικής δέσμευσης εκκινητών μειώνεται.
7. Ειδική για την ομάδα PCR(eng. group-specific PCR) - PCR για σχετικές αλληλουχίες εντός του ίδιου ή μεταξύ διαφορετικών ειδών, χρησιμοποιώντας συντηρητικούς εκκινητές για αυτές τις αλληλουχίες.

Εάν η αλληλουχία νουκλεοτιδίων του εκμαγείου είναι εν μέρει γνωστή ή καθόλου άγνωστη, μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκφυλισμένοι εκκινητές, η αλληλουχία των οποίων περιέχει εκφυλισμένες θέσεις στις οποίες μπορεί να εντοπιστεί οποιαδήποτε βάση. Για παράδειγμα, η αλληλουχία εκκινητών θα μπορούσε να είναι: ...ATH..., όπου Η είναι Α, Τ ή C.

Ποια βιολογικά υλικά μελετώνται;

Διάφορα βιολογικά μέσα και ανθρώπινα υγρά μπορούν να χρησιμεύσουν ως υλικό για την έρευνα PCR, στην οποία μπορεί να ανιχνευθεί ξένο βακτηριακό DNA ή ιικό DNA ή RNA:

1. Ούρο. Μπορεί να χρησιμοποιηθεί για λοιμώξεις του ουρογεννητικού συστήματος στους άνδρες και των οργάνων του ουροποιητικού στις γυναίκες (στους άνδρες, η χρήση ούρων ως υλικού αντικαθιστά την απόξεση του επιθηλίου).
2. Πτύελο. Χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της φυματίωσης και, σπανιότερα, για τη διάγνωση των αναπνευστικών μορφών χλαμυδίων και μυκοπλάσμωσης. Τα πτύελα σε ποσότητα 15-20 ml συλλέγονται σε αποστειρωμένη (μιας χρήσης) φιάλη.
3. Βιολογικά υγρά. Χυμός προστάτη, υπεζωκοτικό, νωτιαίο, αμνιακό υγρό, αρθρικό υγρό, βρογχοκυψελιδική πλύση, σάλιο συλλέγονται σύμφωνα με τις ενδείξεις.
4. Ξύσεις επιθηλίου από τους βλεννογόνους. Χρησιμοποιείται συνήθως για τη διάγνωση σεξουαλικά μεταδιδόμενων ασθενειών (ΣΜΝ), όπως γονόρροια, χλαμύδια, μυκοπλάσμωση, ουρεαπλάσμωση, τριχομονάση, γαρδνερέλλωση, έρπης και άλλες λοιμώξεις που επηρεάζουν τους βλεννογόνους.
5. Βιοψίες. Τις περισσότερες φορές, βιοψίες του στομάχου και του δωδεκαδακτύλου χρησιμοποιούνται για την ανίχνευση λοίμωξης από ελικοβακτηρίδιο του πυλωρού.
6. Αίμα, πλάσμα, ορός. Χρησιμοποιείται για ανάλυση PCR της ηπατίτιδας B, C, D, G, έρπητα, CMV, ιών HIV και έρευνα ανθρώπινων γονιδίων.

Πώς να προετοιμαστείτε για τη δοκιμή;

Η αξιοπιστία του αποτελέσματος της PCR εξαρτάται άμεσα από τη σωστή υποβολή του υλικού για εξέταση. Το υλικό δεν πρέπει να είναι μολυσμένο, διαφορετικά το αποτέλεσμα της μελέτης δεν θα είναι αντικειμενικό. Οι πιο σημαντικές συστάσεις πριν από τη λήψη μιας δοκιμής PCR περιλαμβάνουν τις ακόλουθες απαιτήσεις:

1. Τα ούρα συλλέγονται το πρωί σε αποστειρωμένο δοχείο.
2. Μια εξέταση αίματος για λοιμώξεις πρέπει να γίνεται με άδειο στομάχι το πρωί.
3. Δεν πρέπει να είστε σεξουαλικά ενεργοί την ημέρα πριν από την εξέταση.

Το αποτέλεσμα της ανάλυσης θα είναι έτοιμο 1,5-2 ημέρες μετά την εν λόγω διαδικασία. Υπάρχουν περιπτώσεις που το αποτέλεσμα μπορεί να προετοιμαστεί την ίδια μέρα.

Αποκωδικοποίηση της ανάλυσης OPC

Η διαδικασία ερμηνείας της παρουσιαζόμενης έρευνας διακρίνεται για την απλότητά της. Τα αποτελέσματα της ανάλυσης PCR μπορούν να ληφθούν 1,5-2 ημέρες μετά την υποβολή του υλικού. Σε ορισμένες περιπτώσεις, το αποτέλεσμα είναι έτοιμο την πρώτη μέρα και να τι μπορεί να σημαίνουν:

• Αρνητικό αποτέλεσμαδείχνει ότι το διαγνωστικό υλικό δεν περιέχει τον επιθυμητό μολυσματικό παράγοντα.
• PCR θετικήσημαίνει ότι το DNA ή το RNA του παθογόνου είναι παρόν στο ανθρώπινο σώμα.

Σε ορισμένες περιπτώσεις, οι μικροοργανισμοί προσδιορίζονται ποσοτικά. Αυτό ισχύει ιδιαίτερα για ασθένειες που προκαλούνται από ευκαιριακούς μικροοργανισμούς. Δεδομένου ότι αυτά τα βακτήρια εμφανίζουν τις αρνητικές τους επιπτώσεις μόνο σε υπερβολικές ποσότητες.

Επίσης, η ποσοτική ανάλυση PCR είναι σημαντική για την επιλογή θεραπευτικών τακτικών και για τον σκοπό της παρακολούθησης της θεραπείας ιογενών λοιμώξεων όπως οι ιοί HIV και ηπατίτιδας.

Πόσο ακριβής είναι η διάγνωση λοιμώξεων με PCR;

Η μέθοδος PCR χαρακτηρίζεται από υψηλή ακρίβεια, ειδικότητα και ευαισθησία. Αυτό σημαίνει ότι αυτή η ανάλυση είναι ικανή:

• να προσδιορίσει με ακρίβεια την παρουσία ή την απουσία μόλυνσης.
• υποδεικνύουν ακριβώς τι είδους μόλυνση είναι (ειδικότητα).
• ανίχνευση μόλυνσης ακόμη και με πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε μικροβιακό DNA σε βιολογικό υλικό,
• που δοκιμάστηκε (ευαισθησία).

Ανάλυση PCR: τιμή και όροι

Η τιμή μιας συγκεκριμένης εξέτασης θα εξαρτηθεί από τη μόλυνση για την οποία θα υποβληθείτε σε εξέταση. Κατά προσέγγιση τιμές και όροι:

1. STI: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
2. Ιός Epstein-Barr, ιός ανθρώπινων θηλωμάτων, έρπης, κυτταρομεγαλοϊός: 300-500 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
3. Ηπατίτιδα A, B, C, D, G: ποιοτική ανάλυση 650 ρούβλια, ποσοτική ανάλυση 2000 ρούβλια. Όροι - έως 5 ημέρες.
4. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, συνολικά (Anti-HCV) – 420 ρούβλια.
5. Αντισώματα στον ιό της ηπατίτιδας C, IgM (Anti-HCV IgM) – 420 ρούβλια.
6. Helicobacter pylori: 300-400 ρούβλια, όροι - 1 ημέρα.
7. HIV (αντισώματα και αντιγόνα) - 380 ρούβλια.
8. HIV RNA, υψηλής ποιότητας – 3.500 ρούβλια.
9. HIV RNA, ποσοτικά – 11.000 ρούβλια.

Για να εξοικονομήσετε χρήματα, μπορείτε να επιλέξετε ένα σταθερό πακέτο ανάλυσης. Αυτή η υπηρεσία παρέχεται από τις περισσότερες κλινικές όπου μπορείτε να κάνετε εξετάσεις χρησιμοποιώντας τη μέθοδο PRC (invitro, onclinic κ.λπ.).

Το επίχρισμα PCR στη διάγνωση μολυσματικών ασθενειών έχει τα ακόλουθα πλεονεκτήματα:

• Άμεση αναγνώριση παθογόνων μολυσματικών ασθενειών.

Πολλές παραδοσιακές μέθοδοι εργαστηριακής διάγνωσης περιλαμβάνουν την αναγνώριση παθογόνων παραγόντων χρησιμοποιώντας διάφορα έμμεσα σημεία. Για παράδειγμα, η διάγνωση ELISA βασίζεται στην ανίχνευση στο αίμα του ασθενούς πρωτεϊνών που είναι προϊόντα αποσύνθεσης μολυσματικών παθογόνων, βάσει των οποίων ο γιατρός μπορεί να κάνει μια συγκεκριμένη διάγνωση. Η μέθοδος ανάλυσης PCR δίνει μια άμεση ένδειξη της παρουσίας ενός συγκεκριμένου τμήματος DNA του παθογόνου στο υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή.

• Υψηλή ειδικότητα διαγνωστικών PCR.

Κατά τη διάρκεια της ανάλυσης, ένα θραύσμα DNA απομονώνεται στο υπό μελέτη υλικό που είναι ειδικό, δηλ. εγγενές μόνο σε ένα συγκεκριμένο παθογόνο - μόνο ένα συγκεκριμένο βακτήριο ή ιό. Αυτό το τμήμα DNA είναι μοναδικό και δεν είναι τυπικό για οποιαδήποτε μόλυνση στη γη.

• Υψηλή ευαισθησία της PCR.

Η ανίχνευση της μόλυνσης είναι δυνατή ακόμη και αν το υλικό που λαμβάνεται από τον ασθενή περιέχει μόνο ένα κύτταρο βακτηρίου ή ιού. Σε σύγκριση με άλλες ανοσολογικές και μικροβιολογικές διαγνωστικές μεθόδους: η ευαισθησία της ανάλυσης PCR είναι 10-100 κύτταρα ανά δείγμα, άλλες μέθοδοι είναι 103-105 κύτταρα.

0Πίνακας ( => Αναλύει) Πίνακας ( => 2) Πίνακας ( =>.html) 2

• Η ευελιξία της ανάλυσης PCR.

Για την έρευνα PCR, μπορεί να χρησιμοποιηθεί σχεδόν οποιοδήποτε υλικό, συμπεριλαμβανομένων εκείνων που δεν είναι διαθέσιμα για έρευνα με άλλες μεθόδους: βλέννα, ούρα, αίμα, ορός, πτύελα, εκσπερμάτιση, απόξεση επιθηλιακών κυττάρων - καθώς η μόλυνση μπορεί να περιέχεται σε οποιεσδήποτε βιολογικές εκκρίσεις και ιστούς.

• Υψηλή ταχύτητα λήψης αποτελεσμάτων ανάλυσης PCR.

Μια κοινή μέθοδος επεξεργασίας υλικού που λαμβάνεται από έναν ασθενή για ανάλυση, ανίχνευση προϊόντων αντίδρασης και αυτοματοποιημένη ενίσχυση PCR καθιστούν δυνατή τη διεξαγωγή πλήρους διάγνωσης PCR σε 4-5 ώρες. Ταυτόχρονα, δαπανάται πολύ περισσότερος χρόνος σε μεθόδους πολιτισμικής έρευνας - από αρκετές ημέρες έως αρκετές εβδομάδες, καθώς είναι απαραίτητο να απομονωθεί και στη συνέχεια να αναπτυχθεί το παθογόνο σε κυτταρική καλλιέργεια.

• Δυνατότητα διάγνωσης κάθε είδους μόλυνσης.

Η υψηλή ευαισθησία της μεθόδου PCR καθιστά δυνατή τη διάγνωση λοίμωξης όχι μόνο στο οξύ στάδιο της νόσου, αλλά και χρόνιων λοιμώξεων, ακόμη και της παρουσίας μεμονωμένων βακτηρίων ή ιών.

Ένα επίχρισμα PCR σάς επιτρέπει να εντοπίσετε λοιμώξεις που δεν μπορούν να ανιχνευθούν σε επίχρισμα για τη χλωρίδα: χλαμύδια, ουρεαπλάσμωση, μυκοπλάσμωση, έρπης των γεννητικών οργάνων.

Ανεξάρτητα από το πόσο σημαντικά είναι τα πλεονεκτήματα της ερευνητικής μεθόδου, η διάγνωση PCR έχει επίσης ορισμένους περιορισμούς. Τα μειονεκτήματα της διάγνωσης PCR περιλαμβάνουν:

• Δυνατότητα λήψης ψευδώς θετικού αποτελέσματος

Η ανάλυση PCR μπορεί να δείξει θετικό αποτέλεσμα ακόμα κι αν η λοίμωξη είναι ήδη νεκρή, «σκοτωμένη» από αντιβιοτικά, αλλά τα νεκρά της κύτταρα εξακολουθούν να περιέχονται στους ιστούς του ασθενούς. Πώς είναι αυτό δυνατόν? Πολύ απλό. Για παράδειγμα, η μόλυνση ζει στα επιθηλιακά κύτταρα (στη βλεννογόνο μεμβράνη των γεννητικών οργάνων ή των ματιών). Και νοσηλεύτηκε. Αλλά χρειάζεται χρόνος για να «ανανεωθούν» τα επιθηλιακά κύτταρα. Εάν το υλικό συλλεχθεί από γιατρό πριν ολοκληρωθεί η περίοδος ανανέωσης των κυττάρων, το υλικό μπορεί να περιέχει νεκρά κύτταρα μόλυνσης. Τα κύτταρα περιέχουν προφανώς γενετικό υλικό - DNA ή RNA του παθογόνου, το οποίο «αναζητά» η PCR. Η PCR δεν διακρίνει τα νεκρά κύτταρα από τα ζωντανά: αναζητά DNA και τα «κλωνοποιεί» σε τεράστιες ποσότητες. Το αποτέλεσμα αυτής της ανάλυσης είναι θετικό. Στην πραγματικότητα, είναι ψευδώς θετικό.

Η αδυναμία της PCR να «διακρίνει» μια νεκρή λοίμωξη από μια ζωντανή επιβάλλει ορισμένες απαιτήσεις κατά τη χρήση της PCR και για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας. Ο κύριος κανόνας, φυσικά, είναι να περιμένουμε μέχρι να εξαλειφθούν πλήρως από τον οργανισμό τα νεκρά υπολείμματα της μόλυνσης, κάτι που για τον μέσο άνθρωπο συμβαίνει μέσα σε 4-8 εβδομάδες. Μετά από αυτό το διάστημα, μετά τη λήψη του τελευταίου αντιβιοτικού δισκίου, μπορεί και πρέπει να χρησιμοποιηθεί η μέθοδος PCR για την παρακολούθηση της αποτελεσματικότητας της θεραπείας.

γαστρεντερολογία διαγνωστικό συγκρότημα - 5.360 ρούβλια

ΜΟΝΟ ΤΟΝ ΜΑΡΤΙΟ εξοικονόμηση - 15%

1000 ρούβλια Καταγραφή ΗΚΓ με διερμηνεία

- 25%πρωταρχικός
Επίσκεψη γιατρού
θεραπευτής τα Σαββατοκύριακα

980 τρίψτε. αρχικό ραντεβού με ιρουδοθεραπευτή

ραντεβού με έναν θεραπευτή - 1.130 ρούβλια (αντί για 1.500 ρούβλια) "Μόνο τον Μάρτιο, τα Σάββατα και τις Κυριακές, ραντεβού με γενικό ιατρό με έκπτωση 25% - 1.130 ρούβλια, αντί για 1.500 ρούβλια (οι διαγνωστικές διαδικασίες πληρώνονται σύμφωνα με τον τιμοκατάλογο)

Σε προηγούμενα στάδια, ο έλεγχος της θεραπείας μπορεί να γίνει μόνο με τη χρήση της μεθόδου καλλιέργειας ή της σποράς: μόνο βιώσιμοι αναπαραγόμενοι μικροοργανισμοί μπορούν να χρησιμεύσουν ως ένδειξη μη θεραπείας.

• Δεν είναι επιθυμητή η χρήση ανάλυσης PCR για τη διάγνωση της gardnerella, καθώς η gardnerella, ο αιτιολογικός παράγοντας αυτής της ασθένειας, ζει συνήθως στον κόλπο σε μικρές ποσότητες. Το DNA αυτών των βακτηρίων θα βρεθεί ξανά και ξανά όταν χρησιμοποιείται PCR. Το Gardnerella δεν πρέπει να υπάρχει στο επίχρισμα και η βακτηριοσκόπηση σε αυτή την περίπτωση είναι επαρκής μέθοδος για τη διάγνωση της γαρδνερέλλας και την παρακολούθηση της θεραπείας.
• Μεταβλητότητα μικροοργανισμών

Κάθε μικρόβιο έχει την ικανότητα να αλλάζει και σε επίπεδο DNA. Το πιο εντυπωσιακό παράδειγμα από αυτόν τον τομέα είναι ο ιός της γρίπης. Έχοντας αρρωστήσει μία φορά, ένα άτομο αναπτύσσει αντισώματα στον ιό. Καθαρά θεωρητικά, αν έχουμε πάθει γρίπη τουλάχιστον μία φορά, τότε όπως η ανεμοβλογιά, δεν πρέπει να την κολλήσουμε δεύτερη φορά. Αλλά αρρωσταίνουμε σχεδόν κάθε χρόνο. Ποιός είναι ο λόγος? Ο ιός «μεταλλάσσεται», «αλλάζοντας» ελαφρώς το γονιδίωμά του, και το ανοσοποιητικό μας σύστημα, τα αντισώματά μας δεν «αναγνωρίζουν» πλέον τον παλιό επισκέπτη με μια νέα μορφή. Όσο λυπηρό κι αν είναι, πρέπει να ξαναπάθεις γρίπη...

Κατά το σχεδιασμό ενός κυκλοποιητή (σύστημα δοκιμής PCR), χρησιμοποιείται ένα θραύσμα DNA ειδικό για έναν δεδομένο μικροοργανισμό, το οποίο είναι λιγότερο ευαίσθητο σε αλλαγές. «Επιλέγεται» από μια λεγόμενη εξαιρετικά διατηρημένη περιοχή DNA. Αλλά η μεταβλητότητα των μικροοργανισμών μπορεί να οδηγήσει στο γεγονός ότι ορισμένοι γονότυποι ή στελέχη του υπό μελέτη παθογόνου μπορεί να αποκτήσουν μεταλλάξεις στο ενισχυμένο (κλωνοποιημένο) τμήμα του γονιδιώματος, και έτσι να γίνουν ασαφείς από ένα δεδομένο σύστημα δοκιμής.

Έτσι, διαφορετικά συστήματα δοκιμών είναι ένας από τους λόγους για τους οποίους οι δοκιμές που γίνονται σε διαφορετικά εργαστήρια και σε διαφορετικές κλινικές χρησιμοποιώντας την «ίδια» μέθοδο PCR μπορούν να δείξουν εκ διαμέτρου αντίθετα αποτελέσματα. Για να αποφευχθούν όσο το δυνατόν περισσότερο σφάλματα λόγω μεταλλάξεων, έχουν αναπτυχθεί πρότυπα που ρυθμίζουν τον όγκο των δοκιμών (συμπεριλαμβανομένης της δοκιμής για διασταυρούμενες αντιδράσεις, καθώς και δοκιμής γνωστών στελεχών του παθογόνου που ανιχνεύεται) που πρέπει να αντέξει ένα σύστημα δοκιμής πριν από αυτό. φτάνει στην αγορά και χρησιμοποιείται για τη διάγνωση της υγείας σας. Αυτός είναι ο λόγος για τον οποίο οι καλές κλινικές και εργαστήρια χρησιμοποιούν τις τελευταίες γενιές συστημάτων δοκιμών. Και το ιατρικό μας κέντρο «Euromedprestige» είναι ένα από τα λίγα που μπορεί να προσφέρει στους πελάτες του διαγνωστικά υψηλής ποιότητας.